【YY医药标准】 一次性使用医用手套生物学评价要求与试验

ICS11.140.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0616—2007
一次性使用医用手套
生物学评价要求与试验
Medical gloves for singleuseRequirements and testing for biological evaluation（EN455-3.2000,MOD)
2007-07-02发布
数码防伪
国家食品药品监督管理局
2008-03-01实施
YY/T0616—2007
规范性引用文件
术语和定义
试验方法
试验报告
附录A（规范性附录）
附录B（资料性附录）
附录C（资料性附录）
附录D（资料性附录）
参考文献
...aa.
用改良LowIy分析法测定天然橡胶手套水溶性蛋白质的方法医用手套可溶出蛋白质和过敏原的免疫学测定方法高效液相色谱法（HPLC)测定氨基酸（AAA）术语·
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本标准修改采用EN455-3：2000《一次性使用医用手套第3部分：生物学评价要求与试验》，与EN455-3：2000无技术性差异，仅将引用的欧洲标准和药典改为我国相应标准和药典。本标准的附录A是规范性附录，附录B、附录C和附录D均为资料性附录。本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心本标准主要起草人：秦冬立、黄经春、由少华、吴平。I
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最近几年，常有报道胶乳产品由于含有胶乳蛋白质使医护人员和病人产生不良反应，由于化学物质、润滑剂、灭菌残留物（环氧乙烷）、致热物等残留物产生的不良反应也在科学文献中有所描述。其中报道最多的是天然橡胶胶乳手套产生不良反应，但其他聚合物制成的手套也可以引起一些不良反应。GB/T16886标准给出了有关医疗器械生物学评价指南，并包括了特定试验和其他涉及安全性规范的试验方案。
本标推未涉及使用医用手套所产生的全部不良反应（如速发型超敏反应），存在于手套中的特异性过敏原会引发这些不良反应，导致这些反应的因素有：a）长期、高频次佩带手套；
皮肤与黏膜直接与过敏原（又称变应原）接触，特别在皮肤与黏膜有损伤的情况下接触过敏原b)
或吸人微粒；
常年使用手套，手套紧密贴敷皮肤。c
本标准给出了用以评价医用手套生物学安全性的试验方法，作为YY/T0316风险管理过程的一部分。
本标准没有规定胶乳蛋白质和化学物质的可接受水平，因为在这一领域有关安全性评价因索（如过敏原的识别、致敏作用阅和过程控制等）尚不十分清楚。随着对其认知的不断提高，预期本标准将会被修订。目前进一步测定和控制这些过敏原的试验方法还处于研究之中。Ⅱ
1范围
一次性使用医用手套
生物学评价要求与试验
YY/T0616—2007
本标准规定了一次性使用医用手套生物学安全性评价的要求，给出了标示和手套包装的要求以及所用试验方法的信息。本标准还包括用于可溶出蛋白质和过敏原测定的免疫学试验方法综述。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1—2001，ISO10993-1:1997,IDT)
GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5—2003，ISO10993-5:1999,IDT)
GB/T16886.7医疗器械生物学评价第7部分：环氧乙烷灭菌残留量（GB/T16886.72001，ISO10993-7:1995,IDT)
GB/T16886.10医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验（GB/T16886.10—2005,ISO10993-10:2002,IDT)
GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12—2005，ISO10993-12:2002,IDT)
YY/T0316医疗器械风险管理对医疗器械的应用（YY/T0316—2003，ISO14971-1：2000，IDT)
中华人民共和国药典二部（2005年版）3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
化学物质chemicals
生产过程的任何工序中或贮存期间添加或形成的物质，包括润滑剂、化学涂层和灭菌剂，这些物质可从最终产品中检出。
内毒素endotoxins
来源于革兰氏阴性菌细胞膜外层结构的脂多糖。注：内毒素来源于原材料、生产过程中的工艺用水和手工处置过程中的细菌污染。3.3
可溶出蛋白质leachableproteins从最终产品中溶出的不同分子量的水溶性蛋白质和肽。注：蛋白质主要来源于天然橡胶胶乳。蛋白质和其他可能添加的蛋白质会在生产过程中发生变性和降解，水中浸提出的蛋白质可引起I型过敏反应。YY/T0616—2007
热原pyrogens
使家免发热的物质，这些物质也能使人体产生发热反应和其他不良反应。注：内毒素是热原的一种。
过程限值processlimit
生产过程中可能产生的最高蛋白质含量。4要求
4.1总则
一次性使用医用手套应按GB/T16886进行评价，并应按照YY/T0316进行风险分析。4.2可溶出蛋白质
制造商应按5.1规定的方法监测含天然橡胶胶乳成品手套中可溶出蛋白质的过程限值。若有要求，应能提供试验结果和所采用的试验方法。本标准与风险分析相结合，用以确定污染物和残留物所涉及的生物学风险是否可以接受。4.3内毒素
如果手套标示“低内毒索含量”，制造商应按5.2规定的方法监测无菌手套内毒素污染。有这种标示的手套，每副手套的内毒素含量应不超过20EU。4.4化学物质
手套应不含有或不涂滑石粉（硅酸镁）。若有要求，制造商应说明生产过程中添加或产品中已知存在的化学成分，如促进剂、抗氧化剂和杀菌剂等依据现有文献资料已知对健康有不良影响的物质。4.5标示
除了其他相关规定的标示要求之外，初包装上至少还应给出下列内容：a）由天然橡胶胶乳制成的医用手套应有以下文字或等效说明：“(产品)含有会引起过敏反应的天然橡胶胶乳。”b）有粉手套应有以下文字或等效说明：“注意：手术前应采用无菌操作法去除表面粉末，以使组织不良反应的风险降至最小。”注：该注意事项可在内包装物上给出。c）制造商如标示含有蛋白质，应给出按5.1规定测定的过程限值；注1.不允许标示蛋白质含量低于50g/g。注2：尚未确定对胶乳过敏的人使用这种手套的安全性。d》不应标示“低变应原性”。
注：注意YY0466—2003给出的符号。5试验方法
5.1可溶出蛋白质
测定可溶出蛋白质的方法应采用附录A给出的改良Lowry法，或经与改良Lowry法比对确认过的方法，详见附录A。
注1：现有确认过的用于可溶出蛋白质分析的其他方法（如附录C给出的确认过的氮基酸分析法），只要能证明这些方法经过确认，并与本标准规定的标准方法有对应关系就允许采用，但这些方法不适合用于常规质量控制。注2：蛋白质免疫学测定法还处在发展过程中(参见附录B)。5.2内毒素
除非鲨试剂（LAL）试验中出现无法排除的干扰现象，对方法的选择、确认和使用应符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）规定的细菌内毒素检查法或具有相同灵敏度和重现性的LAL。试2
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验方法。LAL试验中如出现无法排除的干扰，不能准确测出细菌内毒索水平，这种情况下可以采用《中国药典》中规定的兔热原试验。LAL试验结果应表示为每副手套含内毒素单位（EU）。每批产品都应进行试验。推荐的手套最小检验量根据批量确定。批量少于30副时，取样量为两副：批量在30副～100副之间时，取样量为3副：批量超过100副时，取样量为3%，但最大取样量为10副。
每副手套的外表面用40mL无内毒素水（《中国药典》中规定的细菌内毒素检查用水）在37℃～40℃下浸提40min～60min，浸提过程中要保证手套的整个外表面与浸提介质接触。必要时将浸提液以2000g离心15min，以除去微粒。离心后取出浸提液立即进行内毒索试验。注：其他现有公认的内毒素分析方法，只要经过确认并与本标准所规定的方法具有相关性，也可用来进行常规质量控制。
6试验报告
试验报告至少应包括下列信息：本标准编号；
手套类型和生产批号：
一制造商或供应商和试验室（如果不同）名称和地址：试验日期；此内容来自标准下载网
一所用试验方法的描述；
一试验结果。
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A.1范围
附录A
（规范性附录）
用改良Lowry分析法测定天然橡胶手套水溶性蛋白质的方法本法用于天然橡胶制成的医用手套内水溶性蛋白质总量的测定，本法已经在实验室间进行的比对试验中得到了确认。本法定量测定蛋白质低限值约为每克手套10g（即每毫升浸提液2g蛋白质）。像表面活性剂、促进剂和抗氧化剂等在手套生产过程中添加到天然橡胶中的化学物质会对显色过程有干扰作用，有些物质可能会降低显色，而有些物质可能会增强显色。如果在试验中因干扰导致出现误差，则可以采用任何经确认过的氨基酸分析方法（如附录C给出的方法）。注：使用该方法的人员应熟悉实验室一般规程。该方法没有涉及安全问题，如使用方法涉及该类问题，使用者有责任建立相应的安全与卫生规程，并确保与国家规定的要求相一致。A.2原理
水溶性蛋白质被浸提到一种缓冲溶液中，然后加人脱氧胆酸钠，用酸使其沉淀、浓缩并将其从水溶性物质（可能对测定有干扰）中分离。沉淀出的蛋白质重新溶解于碱中，并用改良Lowry法比色定量。分析的原理是基于蛋白质与铜和Folin试剂在碱性介质中反应呈现蓝色的特征，用分光光度计在600nm～750nm波长范围内测量。A.3试剂
A.3.1总则
试验用水应为二次蒸馏水或相同质量的水，所有试剂应为分析纯。A.3.2浸提介质
A.3.2.1N-三（羟甲基）甲基2-氨基乙烷磺酸（TES），半钠盐（hemisodiumsalt）。注：英文名称为N-tris-[Hydroxymethyl-methyl-2-amioethanesulfonic acid(TES)。A.3.2.2浸提缓冲液，用水溶解24gTES(A.3.2.1）并稀释至1L，任何能使手套浸提液的pH值保持在7.4士0.2的等效的缓冲系统都可以使用。注：制备足量的手套浸提液（A.6.2)、蛋白质标准液(A.6.3.2)和空白液。A.3.2.3染色液，溴酚蓝的钠盐溶液，用水溶解100mg溴酚蓝并稀释至1L，保存4周。A.3.3Lowry蛋白质分析试剂盒
注：该试剂盒可以采用现用的化学品制备19，也可以购买成套试剂。本标准的方法是用成套试剂”进行确认。A.3.3.1试剂A，铜试剂（碱性酒石酸铜或柠檬酸铜溶液）。A.3.3.2试剂B，稀释的Folin试剂。A.3.4氢氧化钠溶液，[c(NaOH)=0.1mol/L]。A.3.5脱氧胆酸钠（DOC)，用水溶解0.15g脱氧胆酸钠并稀释至100mL。溶液制备后保存4周。A.3.6三氯乙酸（TCA），4.4mmol/L水溶液，用水溶解72gTCA并稀释成100mL即得。溶液制备后保存4周。
A.3.7磷钨酸（PTA），用水溶解72gPTA并稀释至100mL。溶液制备后保存4周。1）LowryMicroDC蛋白质成套分析试剂（分类号为500-0116）可从BioRad实验室购得，地点：2000AlfredNobelDrive，Hercules，CA9456547，USA。这一信息仅为本标准的使用者提供便利，并不意味着CEN对这一产品的认可。
A.3.8卵清蛋白，从冻干的鸡蛋中提取，无盐。A.4仪器
A.4.1合成手套，无粉。
A.4.2离心机，离心力至少可达到6000g。YY/T0616—-2007
A.4.3离心试管，30mL或50mL聚丙烯试管，试管的蛋白质吸附量每管不超过10μg，不要使用玻璃器具，因其表面吸附蛋白质。
注：第A.5章给出了一种测定蛋白质吸附量的方祛。A.4.4滤膜，一次性使用，孔径为0.22μm，每个滤膜的蛋白质吸附量不超过10μg。注：第A.5章给出了一种测定蛋白质吸附量的方法。A.4.5注射器，一次性使用，20mL，用聚乙烯或聚丙烯材料制造。微型试管，2mL，用聚丙烯材料制造。A.4.6
石英比色池，1cm。
酶标板，96孔，平底，用聚苯乙烯材料制造，或一次性板池（A.4.9）。一次性板池，1.5mL半微型，1cm，用聚苯乙烯材料制造。酶标仪，波长范围600nm~750nm。分光光度计，波长范围230nm～750nm。涡旋式混合器。
微量移液器，带有一次性聚丙烯吸头。夹具，用于浸提过程中密封手套防止漏水。推荐使用衬有泡沫橡胶可旋紧的铝质夹具（见图A.1)，或170mm长的血液透析塑料夹具。5
外手套：
2—内手套：
3—浸提缓冲液；
染色溶液；
手套夹具。
图A.1手套浸提
2）该卵清蛋白是用鲜鸡蛋白通过在pH4.5下用硫酸铵分馏和反复结晶制得。如SigmaA5503、鸡蛋白，V级，可从SigmarChemicalCo.P.O.Box14506,StLouis，MO63178，USA购得。这一信息仅为本标准的使用者提供便利，并不意味着CEN对这一产品的认可。5
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A.4.15振荡器。
A.5蛋白质吸附量测定
A.5.1总则
推荐使用一次性聚丙烯器具（聚丙烯被认为具有低蛋白质结合力）。在使用一批新的离心试管或过滤装置以前，应使用下列方法检查其蛋白质结合力。试验应在1d之内进行。A.5.2离心试管的蛋自质吸附量
A.5.2.1在离心试管（A.4.3）中加30mL含10μg/mL卵清蛋白的标准溶液，标准溶液的配制方法是用浸提缓冲液（A.3.2.2)稀释蛋白质储备液（A，6.3.1）。A.5.2.2移取10mL卵清蛋白溶液（A.5.2.1)至新的离心试管中，在振荡器（A.4.15）上振荡。确保试管所有表面被溶液浸润，30min后再将此管溶液移至另外一个试管中振荡。以此步骤浸润5支试管后收集剩余试验液。同法操作平行管。A.5.2.3用A.6.4～A.6.6所给方法分别测定标准溶液和两份试验液中蛋白质浓度，各测量三次。A.5.2.4按式（A.1)计算每管卵清蛋白平均吸附量：O=10(R-T)/5
-2(R-T)
式中：
O吸附的卵清蛋白量，单位为微克（μg）；R一一标准落液卵清蛋白含量三次测量的平均值：T一试验液卵清蛋白含量的平均值（即六个测量值的平均值）。每管吸附的卵清蛋白量(O)应小于10μg。否则，这些试管不适合用于测量。A.5.3过滤装置的蛋白吸附量测定..(A.1)
A.5.3.1在离心试管（A.4.3)中加30mL含10μg/mL卵清蛋白的标准溶液，标准溶液的配制方法是用浸提缓冲液（A.3.2.2)稀释蛋白质储备液（A.6.3.1)。A.5.3.2准备两叠滤膜（A.4.4)，每叠五张，每叠过滤10mL标准溶液至一离心试管中（A.4.3）。A.5.3.3用A.6.4~A.6.6所给方法分别测定标准溶液和两份试验液中蛋白质浓度，各测量三次。A.5.3.4按式（A.2)计算每管卵清蛋白平均吸附量：O=10(R-T)/5
式中：
O一吸附的卵清蛋白量，单位为微克（μg）；R——标准溶液卵清蛋白含量三次测量的平均值：T一试验液卵清蛋白含量的平均值（即六个测量值的平均值）。每滤膜吸附的卵清蛋白量(O)应小于10μg。否则，这些滤膜不适合用于测量。A.6步骤
A.6.1总则
.（A.2)
步骤包括了手套浸提、然后以系数5对浸提液浓缩，使其纯化。用同法浓缩的蛋白标准液制作校准曲线，依据校准曲线测定浸提液中蛋白质含量。取两只手套，同时浸提一只的内部和另一只的外部。这可使浸提体积最小至25mL，且由于浸提缓冲液只与手套接触，避免了与容器表面接触所引起的蛋白质损失。注：其他浸提步骤只要参比本方法经过确认也可以使用。在欧洲和美国与所选定的一些实验室中所进行的实验室间的比对试验表明，按ASTMD5712标准把手套剪成碎片再在pH值为7.4的TES缓冲液中25℃C下浸提2h的测定结果与本法相当。
A.6.2浸提步骤
A.6.2.1戴合成手套（A.4.1)操作手套样品。YY/T0616—2007
取8只同规格、同批手套样品，并分成4对。若手套是分左右手的，则择选4只右手样品、4只左手样品，分成两对右手和两对左手。先在每对手套中选一只自中指尖向腕部取20cm处做一标记，称量（m），精确到0.1g。再将另一只手套插人到做了标记的手套内，使其完全吻合，如图A.1所示。注：将一只手套插入另一只的方法对试验并不十分重要，但其操作要尽可能简化。为此可以先向内手套的拇指和小拇指插人一圆棒帮助将其插人外手套的相应的手指内，同样用圆棒将其他三个指插人。A.6.2.2将足量的染色液（A.3.2.3)充满内手套的五个手指内。在内外手套之间注人温度为（25土5)℃的浸提缓冲液（A.3.2.2）。对于规格较大的手套，加人的缓冲液体积可增加至50mL。排出大多数空气泡，并按图A.1所示用夹具（A.4.14）在20cm标记处密封，以防止液体漏出。A.6.2.3将手套置于振荡器（A4.15）上于（25±5）℃下振荡（120士5）min。A.6.2.4取下夹具，仔细分开手套。注意不要使染色液污染浸提液，如果浸提液呈蓝色，应弃之用新手套重新浸提。
A.6.2.5将浸提液移人离心试管（A.4.3）中，不低于2000g离心15min，或用一次性使用滤膜(A4.4）过滤，也可两种方法并用，使之澄清。制得的清澈液可在2℃～8℃下冷藏并在48h内测定，也可在一18℃以下冷冻，不超过两个月内测定。A，6.2.6从浸提过的外手套20cm标记以上的腕部切下，用吸水纸擦去表面液体，室温下晾干，称量（m2），精确到0.1g，按式（A.3)计算该手套浸提部分的质量：m=mi-m2
A.6.3蛋白质标准液
A.6.3.1蛋白质储备液
....(A.3)
将25mg卵清蛋白溶解于25mL浸提缓冲液（A.3.2.2），制备标称浓度为1mg/mL卵清蛋白溶液。用0.22μm滤膜（A.4.4)过滤，用UV分光光度计在280nm处用石英池（A.4.7）测定吸光度，计算实际卵清蛋白浓度。吸光度除以0.7153即是实际的浓度值（mg/mL）。该溶液在冷藏条件下可稳定2d，在一18℃以下冷冻可稳定两个月。解冻需在45℃下加热15min。A.6.3.2蛋白质标准液
用浸提缓冲液（A.3.2.2)稀释储备液制成系列标准液。使溶液浓度约为100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL和2μg/mL用浸提缓冲液作空白。这些溶液在冷藏条件下可稳定2d，在一18℃以下冷冻可稳定两个月。解冻需在45℃下加热15min。A.6.4蛋白质的沉淀与浓缩
A.6.4.1在（25士5)℃下做平行试验。A.6.4.2精确移取空白液，蛋白质标准液（A.6.3.2）和三个手套的浸提液（A.6.2.5）各1mL至微型试管（A.4.6）中。加0.1mLDOC（A.3.5），涡旋混合后放置10min，加0.1mLTCA（A.3.6）和0.1mLPTA（A.3.7），涡旋混合后放置30min。A.6.4.3在6000g下离心15min。倒出上清液，并将各试管倒置于吸水纸上5min。A.6.4.4向包括空白在内的各试管中加0.1mol/L的氢氧化钠溶液（A.3.4)0.2mL。在涡旋混合器上混合使沉淀出的蛋白质溶解。确保使蛋白质完全溶解成清澈液。有些手套有时需在（5士3）℃下过夜冷藏。如果仍有沉淀物，以0.20mL为单位，逐步加入标定过的氢氧化钠溶液，最多至总量为1mL，以后步骤均用0.2mL的整数倍。沉淀前稀释这种样品浸提液可能是有效的。3）假定分子量为43000Da，280nm和pH7.4下30745的摩尔消光（molarextinctoin），1cm比色池下pH7.4的0.1mol/LTES缓冲液中1mg/mL卵清蛋白的消光是0.715。7
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注：将蛋白质沉淀后再溶解的目的是使蛋白质纯化，排除干扰物。这一过程中难免会有一定量的蛋白质损失。本试验假定蛋白质标准液损失与样品浸提液中损失的百分比相同，但尽管如此，宜使损失为最小，因为过量的损失是不能补偿的。
A.6.5显色
A.6.5.1本标准所描述的方法是采用市售的用于确认的试剂盒，其他试剂盒或自行制备的试剂可能需要采用不同的体积和培养时间。A.6.5.2向含有再次溶解的蛋白质溶液和空白微型试管中加0.125mL试剂A（A.3.3.1），充分混合。加1mL试剂B(A.3.3.2），加盖。涡旋混合30min，使显色完全。这一阶段会产生沉淀，测量吸光度前离心或滤除沉淀物。
A.6.6测量
A.6.6.1酶标仪
移取一定量的溶液（A.6.5.2）至酶标板（A.4.8)的孔中，充满孔，如500μL孔中注人490μL。在600nm~750nm规定波长范围内以空白作参比测量吸光度。注：标准液和手套浸提液在显色稳定后1h内进行分析，这样做的结果具有一致性。A.6.6.2分光光度计
移取溶液（A.6.5.2)至一次性板池（A.4.9），在600nm760nm规定波长范围内以空白作参比测量吸光度。
注：标准液和手套浸提液在显色稳定后1h内进行分析。这样做的结果具有一致性。A.7结果表示
A.7.1计算
A.7.1.1校准曲线法
计算平行测量的平均吸收度。如果个值超出均值的20%，重新测量。绘制平均吸光度对应于原蛋白质标准液的实际浓度校准曲线，如图A.2所示。在蛋白质标准液含量为0μg/mL～100μg/mL的范围内校准曲线应为线性。
注：在浓缩过程中损失一部分蛋白质，假定浓缩过程中蛋白质标准液损失与样品浸提液中损失的百分比相同。1
浓度/（μg/mL）
吸光度
吸光度
计算机生成的最近似的方程式
y-4E0.5t2+0.013x+0.0247
分光光度计用1cm池在750nm下测得的典型标准曲线
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