【GB国家标准】 微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定 抑菌圈法

GB/T 38483—2020 ICS 07.080 A21 中华人民共和国国家标准 GB/T 38483—2020 微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定 抑菌圈法 Determination of Antibacterial Activity for Microbial Secondary Metabolites—Inhibition Zone Method 2020-11-19发布 2020-11-19实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院。 本标准主要起草人：申屠旭萍、叶子弘、马爱进、俞晓平、许益鹏、崔海峰、张雅芬。 1 范围 本标准规定了采用抑菌圈法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性的方法。 本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 抑制中浓度（IC50） Median Inhibitory Concentration 对细菌的抑制率达到50%时的浓度。 3.2 抗细菌活性（Antibacterial Activity） 抑制细菌生长繁殖的能力。 3.3 抑菌圈（Inhibition Zone） 固体培养基表面与试样接触的边界处无菌繁殖的环带区域。 4 原理 利用待测次生代谢产物在琼脂平板中扩散，使其周围的细菌生长受到抑制并形成抑菌圈，根据抑菌圈大小计算IC50，以判定其抗细菌活性。 5 实验室生物安全要求 应符合GB 19489的规定。 6 试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。 6.1 水 GB/T 6682规定的一级水。 6.2 LB液体培养基 称取胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化钠10.0 g，加入1000 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装于锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。 6.3 LB固体培养基 称取胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化钠10.0 g、琼脂20.0 g，加入1000 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装于250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。 6.4 指示菌标准菌株 革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538。 革兰氏阴性菌：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 11229。 也可根据实际情况采用其他标准菌株作为供试菌。 7 仪器设备 7.1 恒温培养箱：温度偏差在±1 ℃以内。 7.2 无菌培养皿：带陶瓦盖，直径90 mm。 7.3 无菌牛津杯：不锈钢材质，标准规格为内径6 mm、外径8 mm、高10 mm。 7.4 抑菌圈测量仪：精度0.1 mm。 7.5 分光光度计：检测波长600 nm。 7.6 无菌锥形瓶：容量100 mL、250 mL。 7.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器。 8 操作步骤 8.1 菌株活化 将菌株接种到装有2 mL LB液体培养基的试管中，在37 ℃±1 ℃条件下培养12 h～18 h。 用接种环挑取菌悬液，以划线法接种于LB固体平板上，在37 ℃±1 ℃恒温培养箱中培养18 h～24 h。随后从平板上挑取单菌落接种于LB固体培养基斜面试管中，在37 ℃±1 ℃恒温培养箱中培养18 h～24 h。 培养后将斜面试管保存于1 ℃～4 ℃冰箱中作为保存菌。保存期不超过1个月，每月传代1次，传代次数不超过10代。 8.2 菌悬液制备 8.2.1 用接种环取保存菌，以划线法接种于LB固体平板上，在37 ℃±1 ℃条件下培养24 h。 注：LB固体平板在1 ℃～4 ℃条件下保存，并应在1周内使用。 8.2.2 取20 mL LB液体培养基加入100 mL无菌锥形瓶中，用接种环挑取8.2.1所得平板上的单菌落接种于LB液体培养基中，在37 ℃±1 ℃条件下培养12 h～18 h。 8.2.3 用LB液体培养基将培养后的菌液浓度调节至1×10^6 CFU/mL～5×10^6 CFU/mL，作为试验菌悬液。 采用分光光度计测定试验菌悬液在600 nm波长下的OD值，控制在0.50～0.65范围内，或采用其他适当方法测定菌悬液浓度。 注：试验菌悬液在1 ℃～4 ℃条件下保存，并应在4 h内使用。 8.3 供试样品制备 按试验要求制备供试样品，确保样品状态满足后续抗细菌活性测定要求。