【国家标准】 饲料中蜡样芽孢杆菌的检测

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T26427—2010
饲料中蜡样芽孢杆菌的检测
Method for determination of Bacillus cereus in feeds(ISO 7932:2004,Microbiology of food and animal feeding stuffsHorizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus-Colony-count technique at 3o C,MOD)2011-01-14发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GB/T26427--2010
本标准使用重新起草法修改采用ISO7932：2004食品和动物何料的微生物学推定蜡样芽孢杆菌计数的水平方法30℃时菌落计数技术》(英文版)。本标准与ISO7932：2004相比在结构上有较多调整，附录B中列出了本标准与ISO7932:2004的章条编号对照一览表。
本标准与ISO7932：2004相比存在技术性差异，这些差异涉及的条款已通过在其外侧页边空白位置的垂直单线（|)进行了标识，附录C中给出了相应技术性差异及其原因的一览表。本标准还做了下列编辑性修改：删除了ISO7937：2004的目次；Www.bzxZ.net
删除了ISO7937：2004的引言；
删除了ISO7937：2004的参考文献；增加了蜡样芽孢杆菌的鉴定技术。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。本标准起草单位：广东省微生物分析检测中心。本标推主要起草人：朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、张鲜姣、陈远良。1范围
饲料中蜡样芽孢杆菌的检测
本标准规定了饲料中蜡样芽孢杆菌的检验方法。本标准适用于饲料中蜡样芽孢杆菌的检测。2规范性引用文件
GB/T26427-—2010
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005,ISO6497.2002,IDT)GB/T20195动物伺料试样的制备（GB/T20195-2006,ISO6498：1998,IDT）SN/T1538.2—2007培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南（SN/T1538.2-2007,IS0/TS11133-2:2003,MOD)3术语和定义
蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus
在选择性培养基上能形成典型菌落，并经本标准指定的方法确证为阳性的细菌。4原理
4.1在选择性固体培养基平板表面涂布特定量的待测液体样品或特定量的其他类型待测样品的初始悬液。在相同的条件下制备待测样品或初始悬液的十倍梯度稀释物。4.2平板30℃培养18b~48h。
4.3典型菌落的数量用确证试验证实，计算每毫升或每克试样中蜡样芽孢杆菌菌数。5稀释液、培养基及试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。
5.1蛋白陈生理盐水稀释液：参见附录A中的A.1。5.2甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基：参见附录A中的A.2。5.3羊血琼脂：参见附录A中的A.3。5.4革兰氏染色液：参见附录A中的A.4。5.5动力培养基：参见附录A中的A.5。5.6甲醇。
GB/T26427—2010
5.70.5%碱性复红染色液：参见附录A中的A.6。6设备和玻璃器血
需配备微生物学常规设备和以下设备。6.1干热灭菌烘箱或湿热高压灭菌锅。6.2干燥箱或培养箱：对流通风，能调节温度至37℃士1℃到55℃士1℃。6.3恒温培养箱：30℃士1℃。
6.4水浴锅：44℃～47℃可调。
pH计：25℃最小检测单位为0.01，精度到土0.1个单位，6.5
玻璃或塑料培养血：直径9cm~10cm，如必要需直径14cm。6.7
刻度吸管：标记容量为1mL和10mL，最小刻度分别为0.1mL和0.5mL。6.8理
玻璃或塑料涂布棒。
显微镜。
7采样
实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。8试样的制备
按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。9操作步骤
9.1检样制备、初始悬忌液和十倍稀释以无菌操作称取试样25g（mL）加人225mL蛋白陈生理盐水稀释液，均质1min~2min，制成1：10的初始悬液。吸取1：10的稀释液1mL，加人9mL蛋白陈生理盐水稀释液，经充分混匀后制成1：100的稀释液。更高稀释度可按此方法操作。9.2接种和培养
9.2.1用无菌移液管分别吸取0.11ⅢL初始悬液（若样品本身为液体，则直接吸取样液）接种到两个日露醇卵黄多粘菌素（MYP)琼脂平板（5.2)上。采用同样操作步骤进行1：100的稀释物的接种和培养，必要时可采用同样操作步骤进行更高适宜稀释物的接种和培养。9.2.2对含蜡样芽孢杆菌数低于15个的样品，接种1mL的初始悬液于140mm直径的平血，或分别接种0.3mL、0.3mL.0.4mL于3个90mm直径的平Ⅲl，使用无菌涂布棒涂布，可以达到10CFU/g的检测下限。每种方法各做一平行，需要140mm直径的2个大平血（或90mm直径的6个小平Ⅱ）。9.2.3使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布摔不得接触平Ⅲ边缘。每个平血用一支无菌涂布棒。涂布好的平Ⅲ盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。9.2.4翻转上述平皿置30C培养箱中培养18h～24h。如菌落较小或无菌落生长，或未见典型菌落，可延长培养24h士3h。
9.3菌落计数
GB/T26427--2010
培养后，选择长有150个菌落以下的平板，最好是两个连续稀释度的平板。计数每血中典型的蜡样芽孢杆菌菌落数典型蜡样芽孢杆菌菌落大，粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有晕圈（表示产生卵磷脂酶)。
注1：如果平板上含有较多的可以发酵甘露醇的微生物，会导致大量产酸，蜡样芽孢杆菌典型的粉红色将减弱或完全消失。
注2：部分蜡桦芽孢杆菌产生很少或不产生卵磷脂酶，这些菌株的菌落周国将不会有晕圈。这些菌落也应该进行确证试验。
如果1.0mL接种液涂布在3个平血上C9.2.2)，相当于1个平板计数和进行确证试验。9.4确证试验
9.4.1菌落挑选和纯化
挑选计数平板上的5个可疑菌落进行确证。如果平板上的可疑菌落数少于5个，挑选平板上所有可疑菌落进行确证。
若平板表面出现过度生长不可能选出良好分离的特征菌落时，应将5个特征菌落划线在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP)琼脂平板上，30℃培养18h～24h。从每一平板中选取至少1个良好分离的粉红色菌落，进行确证试验。
9.4.2羊血琼脂上的溶血试验
挑选纯化的菌落划线、穿刺或点接在羊血琼脂（5.3)表面，30℃培养24h士2h，观察溶血反应。蜡样芽孢杆菌茵落周围呈现溶血环。9.4.3，形态观察
将挑选纯化的菌落做革兰氏染色（5.4)镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。9.4.4动力试验
用接种针挑取选出的菌落穿刺接种于动力培养基（5.5)中，30℃培养24h士2h，蜡样芽孢杆菌有动力，沿穿刺线呈扩散生长。
9.4.5蛋白质结晶毒素试验
取经30℃培养24h士2h并于室温放置2d～3d的培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水浪涂成薄膜。待自然于燥后用弱火焰固定。于涂膜处加甲醇，半分钟后倾去甲醇，置火焰上干燥。然后滴加0.5%碱性复红染色液（5.7)，置火焰上加热至微见蒸汽（勿使染液沸腾）后维持1.5min，移去火焰，将载玻片放置0.5min，倾去染液。用洁净自来水彻底漂洗、晾干，镜检。在油镜下观察有无游离芽孢和深染的似菱形的小结晶体（如游离芽孢形成得不丰富，应将培养物置室温1d～2d再行检查）。蜡样芽孢杆菌应为阴性，无深染的似菱形的小结晶体。9.4.6试验结果
试验结果见表1。
GB/T 26427-2010
MYP琼脂(9.4.1)
血试验(9.4.2)
形态观察(9.4.3)
动力试验（9.4.4)
蛋白质结晶毒素试验（9.4.5）
表1试验结果
确证为蜡样芽孢杆菌的试验结果形成粉红色菌落，周围有晕圈
阳性·
革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大
阳性，沿穿刺线呈扩散生长
。不同菌株红血球溶解圈大小可能不同。10结果计算与报告
10.1每个平板中蜡样芽孢杆菌的数量每个平板中蜡样芽孢杆菌菌落数的计算见式（1）：6
式中：
每块平板上的蜡样芽孢杆菌菌落数；一挑取后经证实为蜡样芽孢杆菌的茵落数，A
一挑取平板上用于验证的菌落数；C平板上的所有特征菌落数。
最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例：
若某板上长有30个典型菌落，从中选出微确证试验的5个菌中有4个证实为蜡样芽孢杆菌，则：×80=24
10.2试样中蜡样芽孢杆菌数的计算方法与报告10.2.1通常情况下试样中蜡样芽孢杆菌菌数的计算方法与报告-（12
10.2.1.1当有两个连续稀释度平板上经确证后的样芽孢杆菌菌数介于15～150之间时，按式（2)计算1mL或1g试样中的蜡样芽孢杆菌菌数N：Za
N=V(n +0. n2)a
式中：
样品中蜡样芽孢杆菌菌落数：
所有平板经确证后的蜡样芽孢杆菌菌落数的总和；平板的接种体积，单位为毫升（mL)；第一个稀释度的平板数；
第二个稀释度的平板数；
第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的&值为1)。-（2）
GB/T26427—2010
按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可记录为1.0～9.9乘以10的指数幂形式。
报告每毫升或每克试样中蜡样芳孢杆菌数量，单位为CFU/g（mL）示例：
若第一个稀释度（10-）经确证后的菌落数为168和215，第二个稀释度（10-\）经确证后的菌落数为14和15，则：0. 1X (2+0. 1×2)×10-=0.002 2 -191 820168+215+14+15
报告每毫升或每克试样中含蜡样芽孢杆菌数量为1.9×10°CFU/g（mL）或190000CFU/g(mL）。10.2.1.2当只有一个稀释度平板上经确证后的蜡样芽孢杆菌菌数介于15～150个时，仍然按式（2)计算1mL或1g试样中的蜡样芽孢杆菌菌数。示例：
如最后一稀释液(10-*)经证实含蜡样芽孢杆菌菌落数分别为120和130，则：N0.11-0.080212 5000
120+130
报告每毫升或每克试样中含蜡样芽孢杆茵数量为1.2×10°CFU/g（mL）或120000C0CFU/g（mL）10.2.2经确证后的蜡样芽孢杆菌菌数低于15个的情况下的计算方法与报告10.2.2.1仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含蜡样芽孢杆菌，且均少于15仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含蜡样芽孢杆菌，且均少于15时，按式（3）计算1mL或1g样品中的蜡样芽孢杆菌数Ne。Ea
式中：
Ne-样品中蜡样芽孢杆菌数；
乙α——两个被选择平板中经确证后的蜡样劳孢杆菌菌落数的总和；V
平板的接种体积，单位为毫升（mL）；d
稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。报告每毫升或每克试样中蜡样芽孢杆菌数量。示例：
某固体样品接种1mL初始悬液的菌落数分别为8和6,则：8+6
1×2×10-1=0.2
报告每克试样中含蜡样芽孢杆菌数为70CFU/g。10.2.2.2液体测试样品原液或其他样品的初始悬液经确证后不含蜡样芽孢杆菌（3）
报告每毫升或每克试样中蜡样芽孢杆菌数量小于1/d(d为液体测试样品原液或其他样品的初始悬液的稀释因子，未经稀释的液体样品d值为1）。GB/T26427—2010
A.1蛋白陈生理盐水
A.1.1成分
酪蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
（资料性附录）
培养基和试剂
1000mL
溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基PH值在25℃时为7.0士0.2。A.2甘露醇卵黄多粘菌素（MYP)琼脂培养基A.2. 1基础培养基
A. 2. 1. 1
牛肉膏
酪蛋白陈
D-甘露醇
氯化钠
蒸馏水
A.2.1.2制法
12. 0 g~18.0 gl)
除酚红外加热溶解各成分，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.2士0.2，加人酚红，分装烧瓶，每瓶90mL，121℃灭菌15min。A.2.2多粘菌素B溶液
A.2.2.1成分
多粘菌素B
蒸馅水
A,2.2.2制法
10°IU
多粘菌素B溶于蒸馏水，过滤除茵。据凝胶强度而定。
A.2.3卵黄液
GB/T26427—2010
取鲜鸡蛋，用硬刷将蛋壳彻底洗净，沥干，放于95%酒精溶液中浸泡30s，风干。以无菌操作取出卵黄，放人灭菌量筒中，加入4倍体积的无菌水，转移至灭菌烧瓶中混匀。水浴44℃~4?℃加热2h，5℃±3℃静置18h～24h，形成沉淀。以无菌操作收集表面乳状液。
此乳状液5℃士3℃放置不可超过72h。A.2.4完全培养基
A.2.4.1成分
基础培养基(A.2.1)
多粘菌素B溶液（A.2.2)
卵黄液（A.2.3）
A.2.4.2制法
灭菌的基础培养基冷却至约44℃～47℃后，加入其他溶液，混匀。水浴44℃~47℃冷却此完全培养基。A.2.5制备琼脂平板
每个灭菌平板倾注完全培养基15mL~20mL，冷却凝固备用。5℃±3℃最多可保存4天。用之前，最好放置在干燥箱中37℃～55℃之间，使琼脂表面干爆。A.2.6性能测试
性能测试见SN/T1538.2—2007中的表B.1。A.3羊血琼脂
基础培养基
A.3.1.1成分
蛋白陈
肝消化酶
酵母膏
氯化钠
蒸馏水
A.3.1.2制法
12.0g~18.0 g2
1 000 mL
热溶解各成分，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.0士0.2，分装烧瓶，121℃灭菌15min。
2）据凝胶强度而定。
GB/T 26427—2010
A.3.2完全培养基
A.3.2.1成分
基础培养基(A.3.1)
无菌脱纤维羊血
A.3.2.2制法
5 mL7 mL
灭菌的基础培养基冷却至约44℃～47℃后，加入无菌脱纤维羊血，混勾。每个灭菌平板至少倾注脱纤维羊血完全培养基12mL，冷却凝固备用。A.4革兰氏染色液
A.4.1结晶紫染色液
A.4.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.4.1.2制法
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.4.2革兰氏碘液
A.4.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.4.2.2制法
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振播，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.4.3沙黄复染液
A.4.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.4.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.4.4染色法
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；8
GB/T26427—2010
滴加95%乙醇脱色，约30s，水洗；滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，特干，镜检。A5
动力培养基
A5.1成分
胰蛋白陈
酵母膏
葡萄糖
磷酸氢二钠
蒸馏水
A.5.2制法
1000mL
热溶解各成分，必要时，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.3士0.2。分装试管，每管约5mL，121℃灭菌15tnin。
A.60.5%碱性复红染色液
A.6.1成分
碱性复红染料
95%乙醇
蒸馏水
A.6.2制法
将碱性复红染料溶解于乙醇中，然后加蒸馏水。如有不溶物时，可用滤纸过滤或静置后取上清液备用。
GB/T26427—2010
附录B
（资料性附录）
本标准与IS07932：2004相比的结构变化情况本标准与ISO7932：2004相比在结构上有较多调整，具体章条编号对照情况见表B.1。表B.1本标准与ISO7932:2004的章条编号对照情况本标准章条编号
9.4.3~9.4.5
10.1~10.2
附录A
附录B
附录C
对应的国际标准章条编号
附录A
附录B
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