【行业标准】 猪附红细胞体病诊断技术规范

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1953—2010
猪附红细胞体病诊断技术规范
Diagnostie technique for Mycoplasma suis(Eperythrozoon suis)2010-09-21发布
2010-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准遵照GB/T1.2009给出的规则起草。本标牌山中华人民共利国农业部提山.本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC18）资口：本标准起节单位：河南省动物疫病预防控制中心。NY/T1953-—2010
本标准起卓人：昊志明、润若潜、张志凌、张缝、刘光辉、连叶、盛敏、方先珍.谢彩华、刘梅芬、王东方主英华。
1范围
猪附红细胞体病诊断技术规范
本标准规定了猪附红细胞体病诊断技术。本标准适用于对猪附红细胞休病的诊断。2诊断方法
2.1猪附红细胞体病的临床诊断
2.1.1流行病学特点
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猪附红细胞体除感染猪外：还可感染人及绵羊、牛、鼠、弱等多种动物：为人畜其患病原体：发病猪和隐性感染猪是本病的传染源。不同午岭、性别，品种的猪均易感。本病一年四季均叫发生，尤其是夏、秋季节。工要通过吸血昆虫传播或通过血液污染的针头和器械传播，也可垂直传播，2.1.2临床症状措标
2.1.2.1发热，体温Ⅱ高到40℃-~42%，食欲下降.精神委顿，呼吸困难，排棕红色尿液2.1.2.2感染初期皮肤測红，后期背部及四股术梢发结，特别是耳廊边缘发纠。2.1.2.3贫血，全身皮航及可视黏膜苓白或黄染。2.1.2.4慢性病猪表珊消瘦、茎白部分猪出现学麻疼或病斑型皮肤变态反应：2.1.2.5血液稀薄，凝固不良，红细胞数量减少。2.1.2.6世猪繁殖障得。
2.1.3病理变化指标
2.1.3.1全身肌肉色泽变激，脂肪及肺、胸腔、胃、肠、膀胱等内脏器官浆腹有不同程度的黄染：2.1.3.2淋巴结、肿脏、肝脏肠大；肾脏肿太，质地变脆，外观黄染2.1.3.3膀跳蒂积棕红色尿液，黏膜英染。2.2猪附红细胞体的涂片染色镜检2.2.1直接涂片镜检
白耳静脉或前腔脉无菌采血，将采集的新鲜血样加等量的生理盐水稀释后，吸取滴置载玻片」，血盖玻片，置10)倍（10义40)光学显微镜下观察。猪附纠细跑休感染猪叫见红细胞发生形态学变化，星锯齿状、案花状或星苎状等；健康猪红细胞形态规则。2.2.2涂片染色镜检
无菌白耳静脉或前腔静脉采血后抹片：经中醇固定3min~5min并下燥后浸人盛有姬姆萨染色液（见附录A)的染色起中染色30min，出水洗，洗十水分，置400倍（13×10)光学显微镜下观察。猪附红细胞体感染猪红细胞呈波浪状，虽芯状、锯齿状改变，且周有染成紫红色的小休（图1A）：健康猪红细胞形态规则，边缘光游，染色均约(图1R)2.3猪附红细胞体的PCR检测
2.3.1试剂和材料
除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。2.3.1.1TE缓冲液(见附录A)、20%ST/S、5%（TAB(-I-入烷基三甲基化铵)，以上试剂常温保存。2.3.1.210mg/ml.溶菌酶、5mol/LNaCl.Tris饱和酚/怎仿/异戊醇(25：24:1).0.1%肝素、1×核NY/T 1953—2010
图1猪血液涂片,姬姆萨染色(400×）酸旦泳缓冲液（见附录A).以上试剂4C保存2.3.1.320mg/ml.蛋白海K，严丙醇，7h%乙醇NA分半景标准，6×电泳上样缓冲液，以上试剂一20保存荐，
2. 3. 1. 4阳性对照、阴棕对照(范降录 A)2. 3.1. 5[CR撑增用上、下游引物序列见附录 E。2.3.1.6猪附红细胞休PCR诊断反应作系红成、说明及使用注意享项见附录C2.3.2仪器设备
1R护增仪，高速冷冻离心机离心小布12心00×以上），该酸电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，28%冰箱，—20℃冰箱，单道微量移液器(0.5L02μl.~20L,20L200：00u~-1009L），凝胶成像系统（或紫外透射仪，真空下燥器（非必备）.2.3.3样品的来集
采样过程中拌本不得交义污染·案样及样品前处理过程中应戴一次性于套、口置，惜子，2.3.3.1取样工具
一次性无菌注射露、离心管。离心管应经121C、151ri高压灭菌i烘十。2.3.3.2采样方法
用无菌注射器先吸人0.1%肝素C.5mL~1ml.呼白H脉或前腔静脉采集_0倍量而液，快速混句店转人无菌离心管中.编号备用。2. 3. 3. 3 存放与运送
采集或处理的样品在2%-8%条栏下保存应不超过21h：采集的栏品密封店，采用保温壶或保湿桶加冰密对，尽快运送创实验室。2.3.4样品的处理Www.bzxZ.net
项530待检样品加人1.5ml离心管中，4条件下12000离心20rmin，弃上清，沉淀加人00uTE缓冲液溶解。取性对照、阴性对照各1，分别加人T缓液，混匀。2.3.5样品IN4的制备
2.3.5.1取个1.5ml.灭菌离心管，其中.为待资样而数加一管册性对照及誉阴性对照之和，对每个离心管进行编号。
2.3.5.2每管加人15L落菌，然后分别人得检样品、阴性对照.陷性对照各200工反复吸汀混勾（一份样品换用个吸头），混约后37水溶1h，2.3.5.3每管加人 10 μl蛋白悔溶液和35uL. SDS液,56%℃水浴35min2.3.5.4每管加入loul.5mol/L的NaC溶液和10L5%CTAB落液，6:水浴10min：2.3.5.5将管加入等休积的份/氯仿/异皮醇混合液，充分颠倒派勾.4C条件下12000×离心10min。
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2.3.5.6取与本标准2.3.5.1中相同数量的1.5mL火菌离心誉，加人150l在20℃预冷的异丙醇，对每个管进行综号。吸取本标准2.3.5.5离心后各管中的上清液150uL转移至相应的普中（江意不要吸出中问），颠倒混与。
2.3.5.7条件下=20c0×g离心15mi。轻轻倒云七清，倒置于吸水纸上吸十液体，不同样品应置于吸水纸不同方：加1mL75%乙醇，轻轻洗涤：2.3.5.84条件下12000×离心5in。轻轻衡去上清液，倒置T吸水纸1吸十液体，不层样品应在吸水纸个同地方吸下。
2.3.5.91℃条件下12030火g离心30s将管壁上的液体用到管底部，用微量移液器尽量将止吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干3min5nmin或窄温T燥10min.不宜过司下燥，以免DNA难以溶解：2.3.5.10证人10mLTFE缓冲液，轻轻混勾，溶解管上的DNA，2000g离心5s.-20C冻存备用2.3.6PCR扩增
配制与木标准2.3.5.1中相同数量的PCR反应体系管，而每管中人2.3.5.10中相应TNA1u。经充分混勺后曦时离心，使液体全部聚集丁管底，加人25L的石蜡油爱盖液面（若PC仪其有热盖加热功能时，PCR反应管中也可不血石蜡油，但推荐采用加石池的方法），并对每个管进行相局的编号：
PCR扩增条件：95℃预变性5mi1.94℃45s.34，458，72℃45%头35个循坏，最后72延伸10min：扩增反虚结内后取山效置于4%。2.3.71PCR扩增产物的电泳检测
称收1.2g琼胎端加人100mL核酸电泳缓冲液中加热，充分辫化后稍效凉，加人适量的溴化2链（终浓度0.5/mL)：倒人胶槽前备凝胶板：在电泳槽中加人核酸电泳缓冲液.使液面刚刚没过凝胶取5-0m.PCR抗增产物利126×.样缓冲液泥合后，分别加样到胶孔：5V/cm拉压下电泳30rmin布右，将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观蔡结果，进行判定并微好试验记录。
2.3.8结果分析
2.3.8.1试验结果成立条件
猪附红细胞体核梭阳性对照的PCR产物，经电泳后在666b位宵出现特异性条带：同时阴性对照PCR产物电泳片在636hp位置没有条带（见附录).则该次试验结果成立；否则，结呆不成立：2.3.8.2阳性
在本次试验结果成立的前提下，如集伴品的PCR产物电泳后在566bp的位置上出现持异性条带判定为猪附红纫胞体核酸印性，若条带极弱，议作一次复磁试验，再次出现665bp人小条带刻定为猪附红细胞体核酸阳性：个则，判为阴性。2.3.8.3阴性
在本次试验钻柔成立的前提下，如果样品的I次产物电泳片在366h节位置木出现特异件条带，判定为猪附红细跑体核酸识性。
2.4猪附红细胞体的实时荧光PCR检测2.4.1试剂和材料
2.4.1.1除不需要2.3.1中均TINA分了量标准，1×核酸电泳缓冲液、6X电冰.上样缓冲液外，其他试剂2.3.1
2.4、1.2实时荧光CR扩增用上、下游引物及荧光探针序列见附录B。2.4.1.3猪附红细胞体实时荧光PCR诊断反应体系的组成、说明及使用注意字项见附录E。NY/T1953—2010
2.4.2仪器设备
除不需要2.3.2中PC尺扩增仪、凝胶成像系统<或紫外透射仪）外，其他仪器设备同2.3.2，并需要增加荧光定量 PCR 仪 I 台。
2.4.3样品的采集和处理
同2. 3. 3 和2. 3. 4,
2.4.4样品DNA的制备
同2.3,5。
2.4.5实时荧光PCR扩增
2.4.5.1在检测区进行。
2.4.5.2配制与本标准2.4.4中相同数量的实时录光ICR反质体系2管.向每管册人2.4.4中相应DNA2μL，充分渴勾后并使液休全部聚集于誉底，按照耍加样品的顺序摆放好实封荧光PCR反应管：
注：不要用笔作炎光TPCR度成管上育接缩，以免影响支光信号的收集。2.4.5.3将本标准2.4.5.2中加样后的实时光PCR反应管效入实时荧光定量PC.R仪内，并记求样本摆汝顺序。
2.4.5.4反应参数设置：第一阶段，预变注91℃/5nin：第二价段，91℃/3，60℃/30s，40个环，在每个循环的延伴结束时进行炭光信导检测，荧光模式设为FAM/IAMRA双记模式。2.4.6结果分析
2.4.6.1结果分析条件设定
2.4.6.1.1读取检测结果，刚值设定原则以阀值线刚好超过正常阴注对照扩增山线的最高点。2.4.6.1.2不同仪器可概据器唤音情况进行调整2.4.6.2质控标准
阴性对照的检测结果成没有特异性扩增出线月t值>32.或无，阴件对照的（值以30.0（附录I），如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效2.4.6.3结果描述及判定
2.4.6.3.1阳性
t值30.0，而且现特定的扩增前线，表明样品中存在猪附红细跑体。2. 4. 6. 3. 2阴性
Ct值32或无，几无持性的扩增曲线，并上阳性对照扩增线C值心30，则判定为阴性。2.4.6.3.3可疑
32.0t值30.C的样本应重做，重做结集无（值或C值32.0者为明性否则为阳性。2.4.6.4无效扩增
如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性效照有C值30的扩增出线，判定本次试验无效，需要分析试验失败原因，并查新试验。3综合判定
3.1疑似
符合诊渐方法2.1.2临床症状指标三条以上（含条），或符诊新方法2.二.3病理变化指标：条以上，或诊断方法2.2中任何一项结果为阳性：3.2确诊
符合结果判定3.1,且诊断方法2.3或2.4结果为附性。4
A.1姬姆萨染色液
附录A
【规范性附录】
试剂的配制
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取娅姆萨染料0.6加入50ml.节油中，置55%-60℃水浴中1.5h~2h后，加人50mL用醇静置1d以上，过滤后即成姬姆萨染色滋原液.贮存备用。怖染色前，于每毫升蒸馅水中加人上述原液一滴，即成姬姆萨染色液。
A.2TE缓冲液
10rutriol/L.Tris-HCl(pH8.0).1mmol/I.EDTA(pH8.0)。A.31×核酸电泳缓冲液
Tris贼24.2%冰乙酸5.71mT:,10 mL0.5i/L.EDTA(pH8.0),加蒸馅水定容垒100 ml使用时用燕溜水作50倍稀释，即为1×核较电泳缓冲液。4.4阳性对照
猪附至缅胞体功能性结构蛋片编码基因(ORF2的pGEM-Tcasy重组质粒（1.0×10°拷贝/uL)。A.5阴性对照
pGFM-Teasy空质粒（1.9X10°拷贝/μL）NY/T 1953—2010
附录13
（规范性附录）
猪附红细胞体PCR及实时炭光PCR诊断方法所用引物B.1猪附红细胞体 PCR矿增用上、下游物序列见表B1表B.1猪附红细胞体PCR扩增用上、下游引物序列引物名称
PCR广池上萨物
PCR扩增下游i物
引物液度
溯序列
2c rmol/gl
- ATTIALCGCAYXTAGATATTTG -3
SAGAAACITCCACTCTTCTCAC-
2t pnel/mL
B.2猪丝细胞体实时荧光PCR扩增用上、下游引物技深钊序列见表B.2表B.2猪附红细胞体实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列浓胺
实制荧光PCR扩增上激物0./LG-ACTGTCXCTACATACTGGTTCTFG·8实时荧光ICR扩增下游.D.μMO./L5·AGCAGAGGGTCACCCAGATC-3扩增止段人术
扩增片段太小
时PCR TaqMa探针 0.μmo/1.FAM-5-ACCICACTGCGTCCAAGTTC A-3'-TAMIRA6
附录C
(资料性附录）
猪附红细胞体PCR诊断反应体系组成、说明及使用注意事项C.1猪阴红细随体PCR诊断试剂盒组成范表（.1表C.1
组成戚分
PCR反应体系
阳性对照
谢对照
TE 缓冲液,pL 1.8. 0>
菌（10mg/ml）
强白(2mg/
2UXSDS
5 M Nal
SSCTAB
卧/氨仿/完设淳混被
异医醇
75的等
5倍IAE电泳缓冲液
化乙缸潜液
上辩缓冲液
石腊汕
C.2说明
猪附红细胞体JCR诊断试剂盒组成效量
20 管(21 uL/管)
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C.2.1PCR反应依系成分：10×PCR缓冲液(合Mg-)2.5u1.,2.5mmoldNTPs2，L.PCR扩增上游引物0.5,PCR扩增下游引物0.5LExugDNA聚合酶9.5（2.5U)，水15.0I..总休积为21T.。
C.2.2PCR反应体系中含猪附红细胞体特性引物对、ExTa酶及各种离子。C.3使用时的注意事项
C.3.1山于阳性样品模板浓度相对较高：注意俭测过程中不得交义污染。C.3.2江意防止试剂盒组分受污染。不同批次试剂盒勿混。C.3.3请按照说期书要求分别在4℃、一23℃保存不同的试剂.试剂盒有效期为6个月。使用时在室温下融化，暂放曾于冰上，使岸后点即向。C.3.4PCR反应体系应避免区复冻，在使用前应瞬时离心以保证反州液焦中在管底NY/T1953—2010
附录D
[资料性附录
猪附红细胞体PCR扩增产物电泳图及实时荧光PCR扩增曲线图D.1猪险红红胞倍PCR扩增产物电图见图D.Tong li
注：MI.eco:[AMarkar；，猪附红初验本阳性对照：3.阴性对照图D.1猪附红细胞体 ICR扩增产物电泳图D.2猪红细胞体实时荧光P(R扩增函线图图1).2。图FeYiexToc IrsaY4·AsyesixrH*国国
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图 1. 2猪附红细胞体实时荧光 PCR 扩增曲线图ree Set
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【资料性附】
NY/T1953--2010
猪附红细胞体实时荧光PCR诊断反应体系组成、说明及使用注意事项E.1
猪附红细胞体实时荧光 PCR 诊断试剂盒组成见表E.1。
表E.1猪附红细胞体实时荧光ICR诊断试剂盒组成纽成成分
PCR反应液
阳降对照
性对照
TE(pH8.0)
溶菌酶<10 tng/ml.)
强白嗨K/20mg/mL)
20%SDS
5 M NaCl
路CTAB
爵/氨仿/异戊醇合液
异芮脖
75%的乙醇
E.2说明
20管（23mL/）
实时荧光PtR反城体系成分：10×PCRBufer<含Mg1），2.5μL;2.5mmoldNTPs.2u,猎附红细胞体实时荧光PCR扩增用上、下游物各0.5uL(0.1umol/.)，TagMan荧光探针1μL(0.8mmol/），Exag嗨0.25（1.25，菌双蒸水（dIT2)16.25购混合：总体积为23E.3使用时的注意事项
E.3.1于阳性样品中模板度相对较高，注意检测过程中不得交叉染。E.3.2江意防止试剂盒组分受污染。不同批次试剂盒勿混用，E.3.3请按照说明书要求分别在4℃、一20℃保存不同的试剂，试剂盒有效期为6个月。使用时在室温下融化,哲放置于冰上，使用后立即汝向。E.3.4PCR反应体系应避免反复冻融，在使用前应时离心，以保证反应液集中在管展。
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