【商检行业标准(SN)】 贝类中星状病毒检测方法 普通CPR和实时荧光CPR方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2519—2010
贝类中星状病毒检测方法
普通PCR和实时荧光PCR方法
Determination of astrovirus in shellfish-ConventionalRT-PCRand real-timeRT-PCRmethod2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-09-16实施下载标准就来标准下载网
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
贝类中星状病毒检测方法
普通PCR和实时荧光PCR方法
SN/T 25192010
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址www.spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印剧厂印刷印张1字数24千字
开本880×12301/16
2010年5月第一版2010年5月第一次印刷印数1—1600
书号：155066·2-20847
本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2519—2010
本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、国家认监委认证认可技术研究所、国家质量监督检验检疫总局标准法规中心、北京金纳信生物科技有限公司。本标准的主要起草人：曾静、魏海燕、杨光、范爱红、饶红、江明、聂棱、张西萌。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
贝类中星状病毒检测方法
普通PCR和实时荧光PCR方法
本标准规定了贝类中星状病毒的普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。SN/T2519—2010
本标准适用于贝类中星状病毒的检测：食物中毒样品中星状病毒的检测可参照使用。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1术语和定义
星状病毒astrovirus
属于屋状病毒科，星状病毒属。病毒颗粒呈球形，无包膜，直径为28nm30nm。病毒基因组为单股正链RNA，长6.8kb，3\端有polyA尾。3.1.2
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的阅值时所经历的循环数。3.1.3
magneticnanoparticles
纳米磁珠
利用纳米技术将磁性材料如Fe:O制成纳米微粒，大小介于原子镁与一般微粒子之间（直径一般小于100nm)，MNP的量子尺寸效应使之展现出许多特有的性质，如比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、吸附能力强等，为生物和医学应用研究提供了更加科学的手段。3.2缩略语
DEPCdiethylpyrocarbonate
焦碳酸乙二酯。
MNPmagneticnanoparticles
纳米磁珠。
SN/T2519—2010
PEGpolyethylene glycol
聚乙二醇。
RNaseribonuclease
核糖核酸酶或RNA酶。
bpbasepair
碱基对。
4方法原理
在偏碱性甘氨酸缓冲液中通过物理研磨的方式对贝类消化组织进行均质，并通过温育促进病毒颗粒的释放，利用PEG8000沉降病毒。然后一方面可以采用Trizol-reagent或其他等效裂解液提取总RNA，并进一步使用包被了oligo-dT的磁珠与星状病毒RNA-3'端的polyA特异结合，纯化病毒RNA；另一方面也可采用纳米磁珠直接从PEG沉降后的病毒悬液中富集病毒粒子，吸附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释放出病毒RNA，无需进一步纯化。上述两种提取病毒RNA的方法分别称为GPTT法(Glycine-PEG-Trizol-olgo-dT)和纳米磁珠法。最后利-用普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行检测。
5试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。匀浆缓冲液：甘氨酸缓冲液(pH%.6)，见附录A.,1.1。5.1
5.2PFG8000溶液：见附录A.1.2
裂解液：Trizol-reagent或其他等效产品。5.4
三氟甲烷。
异丙醇。
无RNase去离子水：见附录A.1.375%乙醇见附录A.1.4。
5.8Poly(dT)磁珠：Dynabeads?mRNAPurificationkit\，包括Oligo(dT)zs磁珠、吸附缓冲液（见附录A.1.5）、漂洗缓冲液（见附录A.1.6以及10mmol/LTri-HCl(pH7.5)。5.9病毒核酸纳米磁珠提取试剂盒：包括纳米磁珠、结合缓冲液以及核酸释放液（北京金纳信生物科技有限公司，Q/HDJNX001-2008)1)。参见附录B。5.10
RNA逆转录试剂盒：SuperScriptIⅢFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR（InvitrogenCat.No.18080-051)或其他等效产品\。荧光PCR混合液试剂盒：UniversalPCRMasterMix(ABI4304437)或其他等效产品\)。5.11
DNA相对分子质量标记：100bp～2000bp。Taq酶：TaKaRa(CodeNo.R1oT1或其他等效产品）\。dNTP：各含2.5mmol/LdATP,dTTP,dCTP,dGTP。50XTAE缓冲液：见附录A.1.7。
溴化乙锭溶液(10μg/μL）：见附录A.1.8。给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使1）
用等效产品。
5.17含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶：见附录A.1.9。10×上样缓冲液：见附录A.1.10。5.18
焦碳酸乙二酯。
SN/T2519—2010
5.20阳性对照：星状病毒阳性样本，或者选用含有星状病毒目的基因的质粒作为阳性对照，星状病毒目的基因序列参见附录C。
5.21引物和探针：普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR共用同一套引物；引物和探针核苷酸序列详见表1。用无RNase的去离子水配制成100umol/L的此存液。普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测所用引物和探针表1
引物/探针
AstUl(+)
AstU2(+)
AstU3(+)
AstU4(+)
AstL1(-)
AstL2()
AstP1(—）
AstP2(-)
AstP3(-)
AstP4(-)
序列（52-3\）
AAGCAGGTAACTGTTGAGGTC
AAGCAAGTCACTTTGAGGTC
AAGCAAGTCACTGTTGAGGTTA
AAGGAAGTCACTGTGGAGGT
GGTTTTGGTCCTGTGAAC
CTGGTTTAGGTCQTGTGACAC
FAM-TCAACGTGTCCGTAACATTGTCAATAA-TAMRAFAM-TCAGCGTGTCCGTAAAATTGTCAATAA-TAMRAFAM-TCAACGTGTCCGTAACATTGTCACTAA-TAMRAFAM-AATCAACGTGTCEGTAAAATJGTCAATAA-TAMRA作用
上游引物
上游引物
上游引物
上游引物
下游引物
下游引物
扩增片段
大小/bp
注1：引物和探针设计参照1型星状病毒Oxford病毒株衣壳蛋白编码基因5'端序列，基因库(GenBank)检索号L23513.1。
注2；实时荧光PCR探针的5'端用FAM进行标，3\端用TAMRA进行标记.也可以根据情况用其他基团进行标记。
仪器与设备
组织匀浆器。
PCR仪。
实时荧光PCR仪。
凝胶成像系统。
空气浴振荡摇床，37℃±1℃，200r/min。涡流混匀器。
电泳仪。
酸度计。
电子天平：量程2kg，感量0.1g。高速冷冻离心机：4℃，10000g。微量可调加样器：10μL，200μL，1000μL低温冰箱：20℃和-80℃。
无RNase的玻璃容器：见附录A.2.1。无RNase离心管：1mL、2mL和50mL，见附录A.2.2。无RNasePCR管：200μL，见附录A.2.2。3
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无RNase液器吸头：10μL、200μL和1000μL，见附录A.2.2。磁性抽提架：适用于1.5mL离心管。无菌剪子和镊子。
磁力搅拌器。
生物安全柜。
实验室要求
实验室设施应达到SN/T1193的要求。星状病毒检测流程
图1为贝类中星状病毒的检验流程图。样品5g+35mL甘氨酸缓冲液，勾浆2min匀浆液于37℃，200r/min振摇30min4℃10000g离心30min
取全部上清液+等体积16%PEG8000，混匀取1mL上清液+0.14mL16%PEG8000冰上放置至少1h
4℃10000g离心10min，弃上清液5mLTrizol重悬沉淀.室温放置5min加1.2mL三氯甲烷，混匀，室温放置5min14℃10000g高心10min
取上清液+0.5倍体积异丙醇，室温放置5min14℃10000g高心10min
75%乙醇洗涤沉淀后无RNase水溶解沉淀DynabeadsOligo(dT)zs进行病毒RNA纯化1mLMNP结合缓冲液重悬沉淀
加50μLMNP，室温放5min~15min磁力吸附MNP5min，吸弃上清液
加50μL核酸释放液，95℃5min
14℃10000g离心5min
取上清液(RNA)转移到无RNase离心管普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR
报告结果
制取样方法
样品的运输与保存
星状病毒的检测流程
储存和运输过程中保持样品温度在0℃～5℃。实验室接到样品后应尽快进行检测。如果暂时不4
能检测应将样品保存于一80℃冰箱中，避免样品的反复冻融。9.2取样
SN/T2519—2010
首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用灭菌消毒的剪刀和镊子取贝类消化腺组织5g。9.3制样
9.3.1在5g消化腺组织中加入35mL匀浆缓冲液（pH9.6)，匀浆器充分匀浆2min。9.3.2将勾浆液置于37℃空气浴振荡摇床中，200r/min振荡30min;4℃，10000g，离心30min。10病毒的检测
10.1GPTT法提取病毒RNA
10.1.1将9.3.2上清液全部移至无RNase的50mL离心管中（可以分装于2个50mL离心管），加人等体积16%的PEG8000溶液（PEG终浓度为8%），颠倒混勾。冰上放置至少1h。4℃，10000g，离心10min，弃上清液。
10.1.2加入5mLTrizol-reagent，用枪头吹打或剧烈涡旋振荡的方式使沉淀充分溶解，室温放置5min。
10.1.3将溶解的沉淀转移至10mL或15mL无RNase的离心管中，加入1.2mL三氯甲烷，剧烈涡旋混匀1min，室温放置5min。
10.1.44℃，10000g离心10min，小心吸取上清液至无RNase的10mL离心管中。加人0.5倍体积异丙醇，上下颠倒充分混匀后室温放置5min。10.1.54℃，10000g离心10min，弃上清液，用预冷的75%乙醇洗涤沉淀10.1.6加人100μL无RNase去离子水，60℃加热5min～10min，使沉淀完全溶解，得到总RNA。10.1.7按照Dynabeads?Oligo(dT)25使用说明从总RNA中纯化病毒RNA，也可按照其他等效产品说明书进行：
将10.1.6所得的RNA溶液置于65℃温育2min，立即置于冰上（打开二级结构）；a）
磁珠的处理：取50μL充分悬浮的DynabeadsOligo(dT)zs磁珠至1.5mL无RNase离心管b）
中，磁性抽提架上放置30s，吸弃上清液。加50μL吸附缓冲液充分重总、洗涤磁珠，磁性抽提架上放置30s，吸弃上清液。重复洗涤一次，最终以100μL吸附缓冲液重悬磁珠。将10.1.7.2所得的100pL磁珠加人10.1.7.1的RNA溶液中，充分混勾，室温放置3min～e
5min。将离心管置于磁性抽提架上1min，吸弃上清液。加人100μL漂洗缓冲液重悬磁珠，磁性抽提架上放置1min，吸弃上清液（尽量吸尽液体）。d)
加人50μL10mmol/LTris-HCl充分重悬磁珠，80℃加热2min后立即于磁性抽提架上放置e
1min，将上清液移至无RNase的1.5mL离心管中，即纯化的病毒RNA。10.2纳米磁珠法提取病毒RNA
10.2.1取9.3.2上清液1mL转移到2mL离心管中，加入0.14mL16%PEG8000溶液（PEG终浓度为2%），额倒5次混匀。冰上放置至少1h，10.2.24℃，10000g，离心10min，弃上清液，向沉淀中加人1mL结合缓冲液，涡流混匀，尽量使沉淀充分溶解。
10.2.3纳米磁珠的处理：取50μL充分悬浮的纳米磁珠至1.5mL无RNase的离心管中，按照10.1.7b)的方法利用结合缓冲液洗涤纳米磁珠两次，最终将其重悬于50μL结合缓冲液中。10.2.4将10.2.3的纳米磁珠加入10.2.2的悬液中，充分混匀，室温下放置5min～15min，每隔1min～2min，颠倒混匀几次。
10.2.5将离心管放置于磁性抽提架上，吸附纳米磁珠5min，弃上清液。10.2.6加人50μL核酸释放液，使磁珠充分悬浮，95℃加热5min，立即置于冰上冷却1min。4℃，5
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10000g离心5min，将含有病毒RNA的上清液转移至无RNase的1.5mL离心管中，进行普通或实时荧光RT-PCR检测，也可暂时于-80℃冰箱保存备用。10.3星状病毒的定性检测
星状病毒的定性检测采用普通RT-PCR和两步法实时荧光RT-PCR方法。10.3.1逆转录
使用SuperscriptⅢfirst-strand synthesissystemforRT-PCR试剂盒进行逆转录反应，反应体系及反应条件见表2，反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当的调整。表2逆转录反应体系与反应条件
下游引物AstL1
下游引物AstL2
缓冲液
RNaseOUT
SuperScript
总体积
工作液浓度
10nmol/L
imol/L
10rmol/L
终浓度
0.5mmol/L
0.5 μmol/L.
0.5μmol/L
上述混合物于65℃，温育5miny立即置于冰上1min。ipx
25 nmol/L
mnol/L
40 U/μL
5 mnol/L
10.mmol/L
2-U/uL
逆转录反应条件：50，50min;85c，5min；立即置于冰上，此时得到的是病毒cDNA。10.3.2普通PCR方法
10.3.2.1普通RT-PCR反应体系
普通RT-PCR反应体系见表
加样量/nL
以星状病cDNA/或含星伏病毒目的基因的质粒作为阳性对照，以不含有星状病毒的贝类cDNA循为阴性对照，以水代替模板作为空白对照，每个反应体系设置两个平行，反应体系浓度可做相应调整。表3“普通RT-PCR反应体系
PCR缓冲液
上游引物（AstU1～4)
下游引物（AstL1～2)
Taq醇
无菌水
总体积
储存液浓度
2.5mmol/L
10 μmol/L
10 μmol/L
5U/μL
2普通RT-PCR反应循环参数
终浓度
200 μmol/L
0.4 μmol/L
0. 4 pmol/L
0.04U/μL
加样量
4条上游引物各加1μL
2条下游引物各加1L
25 μL
普通RT-PCR反应循环参数见表4，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。6
94℃4min
表4普通RT-PCR反应参数
扩增条件
94℃,3s
53℃，30s
72,45 s
10.3.2.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测循环次数
SN/T2519—2010
72℃.5min
将适量50×TAE稀释成1XTAE溶液，配制溴化乙锭含量为0.5g/mL的1.5%琼脂糖凝胶。取15μLPCR产物，加1.5μL上样缓冲液点样，在琼脂糖凝胶的两边或中间位置点样DNA分子量标记，用来判断PCR产物片断的大小源-电泳电压根据电冰槽的长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm，当电泳指示剂溴蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳结果检测采用凝胶成像系统。10.3.3实时荧光PCR检测
10.3.3.1实时荧光PCR反应体系
使用UniversalPCRMasterMix(ABI4304437）试剂盒进行两步法实时荧光RT-PCR，实时荧光RT-PCR反应体系见表5，也可使用其他等效的荧光PCR检测试剂盒。以星状病毒cDNA或含星状病毒目的基因的质粒作为阳性对照，以不有星状病毒的贝类cDNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照，每个反应体系设置两个平行，反应体系浓度可做相应调整。表5
Universal PCR Master Mix
上游引物(AstU1～4）
下游引物（AstL1～2)
探针(AstP1～4)
水(无RNase）
总体积
实时荧光RT-PCR反应体系
储存液浓度
jopmol/L
10 μmol/L
10 μmiol/L
10.3.3.2实时荧光PCR反应循环参数实时荧光PCR反应参数见表6
终浓度
0.4pmol/L
0.4μmol/L
0,04pμmolXL
表6实时荧光RT-PCR反应参数
UNG酶作用
50℃2min
热启动
95℃,10min
注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。11
结果判定及表述
普通PCR结果的判定
对照结果
阳性对照：有扩增条带；
阴性对照：无扩增条带；
空白对照：无扩增条带；
扩增条件
95℃,15s
60,1min
加样量
各1μL
各1μL
各0.1μL
25 μL
循环次数
SN/T 2519-2010
d）否则，实验视为无效。
11.1.2检测结果判定
11.1.2.1同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品无扩增条带，则判断样品中未检出星状病毒。
11.1.2.2同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品有扩增条带，进一步通过荧光PCR方法进行验证，荧光PCR方法验证结果为阳性，则可判定样品检出星状病毒；或对PCR产物进行测序分析比对，PCR产物核酸序列与星状病毒cDNA序列相一致，则可判定样品检出星状病毒。11.2荧光PCR结果的判定
11.2.1对照结果
阳性对照：有荧光增幅现象；
阴性对照：无荧光增幅现象；
空白对照：无荧光增幅现象；
否则，实验视为无效。
检测结果判定
同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品无荧光增幅现象，则判断样品中未检出星状病毒。
11.2.2.2同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值《35时，则判断样品中检出星状病毒。11.2.2.3同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值≥40时，则判断样品中未检出星状病毒。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，则判断样品中检出星状病毒。11.3结果表述
11.3.1根据11.1和11.2描述判定检出星状病毒，则表述为检出星状病毒或星状病毒阳性。11.3.2根据11.1和11.2描述判定未检出星状病毒，则表述为未检出星状病毒或星状病毒阴性。12安全措施
12.1实验室安全防护按GB19489中的规定执行。12.2实验中使用的焦碳酸二乙酯具有致癌作用，应载乳胶或PE手套进行操作。焦碳酸二乙酯具有挥发性，应在通风橱或通风良好的环境中配制和使用；所有使用过的器皿应于121℃高压30min后再进行清洗。
13防污染措施
检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。8
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