【国家标准(GB)】 畜禽体细胞库检测技术规程

ICS65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T24862—2010
畜禽体细胞库检测技术规程
Technical regulation of farm animals somatic cell bank detection2010-06-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-01-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。前言
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧善医研究所本标准主要起草人：马月辉、关伟军、李向臣、于太永、李哈、何晓红、刘涛GB/T24862—2010
1范围
畜禽体细胞库检测技术规程
本标准规定了畜禽体细胞库检测方法。本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽体外培养细胞鉴定。2规范性引用文件
GB/T24862—2010
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
cell motilityrate
细胞活率
活细胞占总细胞的百分比。
cell growthcurve
细胞生长曲线
在一代细胞生存期内，依据潜伏期、指数增长期、停滞期和衰亡期细胞动态变化的数值，以细胞培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标而绘制的细胞生长规律曲线。3.3
karyotype
体细胞分裂中期整套染色体按照其数目、长度、着丝点位置、随体、主缝痕和次缢痕等相对恒定特征排列起来的图像。
同工酶
isozyme
功能相同结构各异的一类催化酶。3.5
Econfluency
汇合度
细胞占其培养表面的比例。
4工作区条件
工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积应不小于3m，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度不少于1.5W/m。紫外线灯管距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。5主要仪器、设备
电泳仪及电泳、超净工作台、冰箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽消毒器、液氮生物容器、离心机、电子天平、恒温培养箱、CO，培养箱、超纯水装置、凝胶自动成像分析系统和显微镜等。1
GB/T24862—2010
6清洗与消毒
6.1玻璃器血清洗与消毒
6.1.1浸泡
所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡12h。6.1.2刷洗
选软毛毛刷.反复洗刷后用清水冲洗3次，三蒸水冲洗3次后，60C下烘干后备用。6.1.3酸浸
酸浸时间为24h。
6.1.4冲洗
酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用重蒸水浸洗3次～5次，烘干包装。6.1.5消毒
高压灭菌应以0.14MPa~0.16MPa的压力下持续15min~30min。6.1.6初次玻璃器血使用
初次使用玻璃器Ⅲ需要先经过浸泡和洗刷再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上：其余操作同6.1.3、6.1.4和6.1.5等步骤。
6.2金属器血清洗与消毒
金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外，其余步骤同6.1。6.3塑料与橡胶制品清洗与消毒
塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡12h.清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30min，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭菌和烘干后备用。高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min。7主要试剂与溶液配制
主要试剂与溶液配制参见附录A。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682一级用水的要求
8体外培养细胞鉴定
8.1细胞形态检测
8.1.1光学显微镜检测
在倒置相差显微镜下，直接观察和记录培养细胞的形态和生长状况。刚贴壁细胞边界清晰，核呈圆形，核浆比率小，细胞排列整齐，无重叠生长8.1.2Giemsa染色检测
将盖玻片置于细胞培养瓶中，在5%CO，培养箱中37C培养，细胞形成单层后，取出盖玻片，用碳酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）冲洗，放在载玻片上，自然干燥。固定液固定10min，Giemsa染色2min，置于显微镜下观察。正常细胞的细胞核被染成紫红色或蓝紫色，细胞质被染成浅红色。
8.2微生物检测
8.2.1细菌和真菌检测
取5L细胞悬液，置于8mL无抗生素培养基中，混匀，300g离心5min，重复2次。再用2mL无抗生素培养基重悬，取0.5mL接种到胰蛋白陈培养基中，置于37℃培养箱以检测细菌；取0.5mL接种到麦芽汁培养基中，置于26℃培养箱以检测真菌。分别培养2周后，晃动悬液，置于显微镜下观察，无异物则细胞未受细菌和真菌污染。2
8.2.2支原体检测
GB/T24862—2010
将畜禽细胞接种到无抗生素的培养基中进行细胞单层培养，待盖玻片细胞汇合度达到50%～60%取出。PBS漂洗，固定液浸泡盖玻片，固定10min后再用PBS漂洗。将Hoechst33258染液滴加到已固定的细胞上，染色30min。用PBS漂洗3次，每次3min～5min。将1滴含1%封片液的PBS滴加到已染色的细胞上，翻转盖玻片盖于载玻片上。用100倍～400倍荧光显微镜观察。细胞核外无蓝色荧光小点或丝状荧光物表明细胞未受支原体污染。8.2.3病毒检测
利用酶联免疫吸附试验、免疫酶试验、免疫荧光试验、血凝试验、血凝抑制试验、免疫酶组织化学、放射免疫测定等方法对畜禽体细胞库进行病毒检测。8.3细胞活率检测
细胞汇合度达到80%~85%，常规法消化，制成1.0×10°个/mL~3.0×10°个/mL的细胞悬液。取一滴悬液和一滴0.4%台盼蓝溶液混匀，静置2min。用血球计数板计算细胞总数和未着色细胞数。8.4细胞生长周期鉴定
细胞汇合度达到80%～85%，常规法消化，制成悬液，计数。分别向培养板21个孔接种1.0×10°个~2.0X10*个细胞，置于37℃C、5%CO,培养箱中培养。每隔24h计数3个孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，取3孔的平均值，连续计数7d。以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。正常生长曲线包括潜伏期、指数增长期、停滞期和衰亡期四个阶段。8.5细胞表面抗原检测
细胞接种在盖玻片上。用固定液固定，一20C放置20min。弃去固定液，用PBS漂洗3次，每次3min，加人血清，静置20min，用PBS洗去血清。加人相应的一抗，37C孵育30min，室温放置1h～3h。用PBS漂洗后，加入相应的二抗，37C孵育20min。用PBS漂洗，封片，镜检。细胞表面特异性抗原与特异性抗体结合，荧光显微镜下进行观察。8.6细胞核型检测
8.6.1秋水仙素处理
取对数生长期的细胞，加秋水仙素使其终浓度为0.1μg/mL～0.4μg/mL。在37C、5%CO，培养箱中继续培养1h～6h，使大部分细胞处于分裂中期。8.6.2分裂相细胞采集
用常规方法消化收集细胞。转入15mL离心管，以300g离心8min，收集细胞8.6.3低渗
弃上清液，加人预热至37C、0.075mol/L(或0.4%)KCl溶液2mL，轻轻吹打，继续加至10mL，37C温箱中温育30min~40min。
8.6.4预固定
在温育后的悬液中加人新鲜固定液1mL，混勾，将悬液以300g离心8min，弃上清。8.6.5固定
加人新鲜固定液5mL，打匀，室温静置20min。300g离心8min，弃上清。8.6.6重固定
重复8.6.5步骤，离心后留1mL～1.5mL上清液，混匀。8.6.7滴片
取2滴～3滴细胞悬液，滴在倾斜45\的预冷载玻片上，干燥。8.6.8染色
用PBS(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色10min，自来水冲洗，干燥。8.6.9封片
将载玻片二甲苯固定两次后，用中性树胶封片。3
GB/T24862—2010
数据分析
统计100个分裂相以确定染色体数目。测量并计算染色体的相对长度、臂比值和着丝点指数，并确定染色体着丝点类型。
8.7细胞同工酶检测
8.7.1样品制备
常规方法消化收集细胞，用PBS重悬，记数。用温育PBS洗细胞3次，离心，弃上清液。用蛋白提取液重新悬浮细胞，密度达5.0×10°个/mL。将细胞悬液移到1.5mL离心管中，4℃下以300g离心2min，吸取上悬液，以每管20aL分装后置一70C贮存备用。8.7.2制板和点样
灌注分离胶，待分离胶聚合好再加满浓缩胶，插上梳子。向上下槽缓缓加人稀释10倍的电极缓冲液至适量，用微量加液器向每个样品槽加人混有1=L～2L溴酚蓝样品液20L~50μL。等量上样，放人4℃冰箱。
8.7.3电泳
120V电泳，待溴酚蓝进人分离胶后调电压至220V。溴酚蓝迁移至下端0.5cm～1cm处停止电泳。
8.7.4染色
切去浓缩胶，用蒸谐水漂洗分离胶两次后，置37C温箱中避光保温染色2h，拍照。4
附录A
（资料性附录）
主要试剂及溶液配制
实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。A. 2
平衡盐溶液
生理盐水或PBS适用于细胞的漂洗。3PBS
GB/T 24862—2010
称取4.00gNaCI、0.10gKCl、1.45gNazHPO.·12H,O、0.10gKH.PO.，加超纯水定容至500mL，调节pH至7.2.高压灭菌，密封后置于4C条件下贮存A.4
生理盐水
称取4.50gNaCl.加入500mL超纯水，高压灭菌，密封后置于4C条件下存A.5www.bzxz.net
5培养基
85%～90%的高糖最低限量必需培养基（minimumessentialmedium，MEM)适用于家禽细胞的培养；85%～90%的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（dulbecco'smodifiedeaglemedium，DMEM)适用于家畜细胞的培养。用于过滤培养基的滤膜直径为0.22m和0.45um。6血清
10%~15%的胎牛血清（fetalbovineserum，FBS)适合于家畜和家禽细胞的培养。A.7消化液
称取0.10g或0.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，调pH至7.2～7.4，定容至100mL。无菌操作台内，0.22μm滤膜过滤除菌、分装，密封后置于一20℃条件下贮存。A.8
MEM或DMEM的基础培养基加人终浓度为1o%二甲基亚矾（dimethylsulfoxide，DMSO)和20%～50%FBS，0.22μm滤膜过滤除菌，密封后置于一20C条件下存。A.9
胰蛋白陈培养基
称取3.00g大豆胰蛋白陈，溶于100mL超纯水中，调pH至7.3，高压灭菌15min～20minA.10麦芽汁培养基
称取2.00g麦芽汁，溶于100mL超纯水中，调pH至3~4.高压灭菌15min~20min。Hoechst33258工作液
称取5.00mgHoechst33258，和10.00mg硫柳汞，溶于100mLPBS，置于棕色瓶中，搅拌30min5
GB/T24862—2010
至完全溶解，分装到1.5mL的小管中制成Hoechst33258贮存液，一20C下避光保存。将1mL的贴存液加到100mL的PBS中，搅拌45min，使终浓度达到5.00μg/mL，4C条件下避光保存A.12封片液
将22.2mL0.1mol/L柠檬酸与27.8mL0.2mol/LNa,HPO,加人到50mL甘油中，调pH至5.5，4℃下保存备用。
A.13固定液
冰乙酸与无水甲醇以1+3的比例混合，现用现配。A.140.4%台盼蓝溶液
称取0.40g台盼蓝，加少量PBS研磨粉碎后，再加PBS至100mL。A.15秋水仙素溶液
称取10mg秋水仙素，溶于10mL超纯水配成贮存液，取1mL秋水仙素贮存液与9mL超纯水混合。
A，16Giemsa工作液
称取1.50gGiemsa干粉，量取50mL甘油，在研钵内先用少量甘油与Giemsa研磨至无颗粒，再将剩余甘油混在一起，56C加热2h后，加人50mL甲醇搅拌均勾，制成Giemsa贮存液，保存于棕色瓶中备用。1mL贮存液与9mLPBS混合，制成Giemsa工作液，现用现配。A.17蛋白提取液
将TritonX-100与0.9%NaCl-0.06mmol/L乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)溶液按1：15的比例混匀，4℃下贮存。A.18胶工作液
A液：称取28.80g丙烯酰胺、8.00g甲叉双丙烯酰胺，用100mL超纯水溶解；B液：称取7.30g三羟甲基甲烷、48mL1mol/LHCl、0.4mL四甲基乙二胺定容至100mL：pH调至8.9：
C液：称取38.00g丙烯酰胺、2.00g甲叉双丙烯酰胺、20mL甘油，定容至100mL；D液：13mL1mol/LHCl,1.50g三羟甲基甲烷，定容至100mL+pH调至6.7；E液：称取30.00g丙烯酰胺、0.80g甲叉双丙烯酰胺，定容至100mL；F液：四甲基乙二胺
A.18.1家畜聚丙烯酰胺凝胶配方分离胶用13.35mL超纯水.7.5mL1.5mol/L三羟甲基甲烷.6mL40%丙烯酰胺.3mL2%甲叉双丙烯酰胺，150L10%过硫酸胺，30LF液：浓缩胶用6.5mL超纯水，1mLC液，2.5mLD液，65μL10%过硫酸胺，25μLF液家畜乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶所用凝胶配方相同，A.18.2家禽聚丙烯酰胺凝胶配方A.18.2.1苹果酸脱氢酶
分离胶：9.375mL超纯水，5.625mLE液，9.375mL1mol/LTris-ClpH8.8），0.625mL1%过硫酸胺，43.35LF液；
GB/T24862—2010
浓缩胶：6.4mL超纯水，1.3mLE液，1.3mL1mol/LTris-Cl(pH6.8），1mL1%过硫酸胺，10LF液。
A.18.2.2乳酸脱氢酶
分离胶：5.69mL超纯水，5.11mLA液，2.84mLB液，11.36mL0.1%过硫酸胺；浓缩胶：6.5mL超纯水，1mLC液，2.5mLD液，65L10%过硫酸胺，25uLF液。A.19
电泳指示剂的配制
称取1.0mg溴酚蓝，用10mL蒸馏水溶解后，定容至100mL。A.20
乳酸脱氢酶染色液
A液：称取100.00mg乳酸钙，溶于20mL0.05mol/LTris-Cl(pH8.0)中；B液：称取5.00mg噻唑蓝（thiazolylblue，MTT），溶于1.0mL超纯水中；C液：称取2.50mg盼嗪硫酸钾酯（phenazinemethosulfate，PMS），溶于1.0mL超纯水中；D液：称取10.00mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）。染色前，将A液、B液、C液和D液混合后，倒入20mL2%琼脂溶液中，混勾。A.21
苹果酸脱氢酶染色液
A液：称取350.00mgDL-苹果酸，溶于25mL0.1mol/LTris-Cl(pH8.0)中；B液：称取15.00mgMTT.溶于1.5mL超纯水中；C液：称取5.00mgPMS.溶于1.0mL超纯水中；D液：称取10.00mgNAD。
将A液、B液、C液和D液混合后，倒人25mL2%琼脂溶液中，混匀。
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