【商检行业标准(SN)】 进出口食品中霍乱弧菌检验方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1022—2010
代替SN/T1022-2001
进出口食品中霍乱弧菌检验方法Detection of Vibrio cholerae in food for import and export2010-01-10发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-07-16实施
本标准代替SN/T1022—2001《出口食品中霍乱弧苗检验方法》。SN/T1022—2010
本标准参照ISO/TS21872-1:2007《食品和饲料的微生物学检验方法致病性弧菌属的水平检验方法第一部分：副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检验（Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp.Part 1Detection ofVibrioparahaemolyticusandVibriocholerae)》、NMKL-methodNo.156，2ed.1997《致病性弧菌属食品中的检测与计数（PathogenicVibriospecies.Deteetionandenumerationinfoods）》，对原标准文本格式、文字表述和文本内容进行修订。本标准与SN/T1022一2001相比，主要变化如下：将原标准名称修订为《进出口食品中霍乱弧菌检验方法》；将原标准的范围进行了修订；
将抽样修订为样品保存与制备。在3.2试样制备中增加了不同类型样品的制备方法。在3.3试样保存中增加了样品的保存方法；增加了方法提要；
-培养基、试剂的配方参照ISO/TS21872-1方法进行了部分修订；一对原标准的检测步骤进行了修订，由同一增菌液中两次增菌的方法修订为两次选择性增菌方法。并针对加工产品，如加热、冷冻、烘干或者盐渍样品，选择37℃进行第一次增菌培养，新鲜样品41.5℃进行第一次增菌培养；增加了显色培养基进行筛选检测。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：徐君怡、曹际娟、王刚、雷质文、郑秋月、杨春华、徐杨、赵昕、齐震玉、刘淑艳。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1022-2001。
1范围
进出口食品中霍乱弧菌检验方法本标准规定了进出口食品中霍乱弧菌的检验方法。SN/T1022—2010
本标准适用于食品中霍乱弧菌的检验，动物饲料和其他食品生产和加工区域环境样品中的霍乱弧菌检验可参照使用。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN0330出口食品中微生物学检验通则第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.1培养基制备指南
SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3样品保存与制备
3.1取样
取样数量及取样方法按SN0330进行。3.2试样制备
3.2.1普通样品
从混合样品中取出代表性样品，将可食部分（带壳贝类按3.2.2方法去除贝壳）充分混匀。用四分法缩分出不小于500g作为试样，装入灭菌容器内，加封标识。3.2.2带壳贝类
应先在清洁的流水中洗净外壳，用70%的乙醇消毒，然后以无菌操作切断闭壳肌，打开贝壳。取出含内脏的全部贝肉和贝液。每个检测样品至少应包括6个贝类个体。3.3试样保存
样品采集后应立即在7℃～10℃保存，24h内检验。如果样品需要冷冻，于一18℃保存，24h内检验。为了最大限度地保证弧菌的存活率，应避免样品与冰直接接触。设备和材料
均质器：8000r/min~10000r/min。4.1
恒温培养箱：37℃±1℃。
恒温培养箱或恒温水浴锅：41.5℃士1℃。4.4
恒温水浴锅：37℃土1℃。
显微镜。
5培养基和试剂
碱性蛋白陈水（APW)，见附录A第A.1章。5.1
5.2TCBS琼脂，见附录A第A.2章。CHROMIDVIBRIO弧菌显色培养基，见附录A第A.3章。5.3
SN/T1022-2010
5.4氯化钠营养琼脂，见附录A第A.4章。5.5氯化钠三糖铁琼脂，见附录A第A.5章。5.6氧化酶试剂，见附录A第A.6章。5.7
鸟氮酸脱羧酶氯化钠肉汤(ODC)，见附录A第A7章。赖氨酸脱羧酶氯化钠肉汤(LDC)，见附录A第A.8章。5.8
精氨酸双水解酶氯化钠肉汤（ADH)，见附录A第A.9章。5.9
β-半乳糖苷酶试剂，见附录A第A.10章。5.10
靛基质氯化钠肉汤，见附录A第A.11章。氯化钠蛋白陈水，见附录A第A.12章。1%氯化钠溶液，见附录A第A.13章5%红细胞生理盐水。
多粘菌素B纸片：50单位。
0/129纸片：10μg和150μg。
霍乱弧菌诊断血清（O1群及O139群）6方法提要与流程
6.1通则
崔乱弧菌通常在样品中数量很少，并可能伴有大量的其他弧菌属的细菌或者其他种属的微生物。为保证检出目标菌，应进行两次连续的选择性增菌。6.2液体选择性培养基中第一次增菌室温下，用待检样品接种碱性蛋白陈水增菌培养基。对于深冻样品、干品和盐渍样品，在37℃士1℃培养6h±1h。对于新鲜样品，在41.p℃士Y℃培养6h士1A
6.3液体选择性培养基中第二次撸菌用6.2中的培养物接种碱性蛋白陈水增菌培养基。在41.5℃土1℃培养18h土1h。6.4分离和鉴定
将6.2和6.3的培养物接种TCBS琼脂利CHROMIDVIBRIO弧菌显色培养基平板以获得分离纯化的菌落，进而进行生化鉴定。6.5检测流程
食品中霍乱弧菌检测流程参见附录B。7检测步骤
第一次选择性增菌
以无菌操作称取25g样品，放人装有225mL灭菌APW增菌液的均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或以剪刀充分剪碎，制成1：10样品匀液。深冻样品、干品、盐渍产品的初始增菌液放置在37℃土1℃培养6h土1h.新鲜样品的初始增菌液放置在41.5℃士1℃培养6h±1h。
如果样品不够25g，则取全部样品，加入9zmL增菌液以获得10-1浓度的样品匀液。如果上述制备的待检样品不能够在当日进行培养，应放置在2℃～8℃保存至次日。注：加人样品前，APW应预先保温至37℃±1℃。7.2第二次选择性增菌
从7.1取1mL培养物接种到10mL的APW中，置于41.5℃土1℃培养18h士1h。7.3分离
7.3.1分别用直径为3mm的接种环从7.1和7.2的APW增菌液中蘸取一接种环，划线接种TCBS2
琼脂和CHROMIDVIBRIO弧菌显色培养基平板以分离菌落。7.3.2在37℃士1℃培养箱中，将平板倒置培养。SN/T1022—2010
7.3.3经过24h士3h培养后，检查平板有无可疑菌落。在平板的背面标记可疑菌落。霍乱弧菌在TCBS上的可疑菌落形态为：表面光滑，黄色，直径约为2mm～3mm。霍乱弧菌在CHROMIDVIB-RIO弧菌显色培养基上的可疑菌落形态为：蓝色，蓝绿色到绿色菌落（某些弧菌如创伤弧菌及梅氏弧菌可能会产生与霍乱弧菌相似的蓝色到蓝绿色菌落）。7.4鉴定
7.4.1选择可凝菌落并纯化苗落
至少应挑取5个可疑菌落，进行传代培养。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取传代培养。
注：食品，待别是海产品，可能含有大量的细菌，包括其他孤菌，这些菌可在选择性培养阶段生长。若在传代培养阶段选择的菌落太少，则可造成自标致病菌的漏检。在氯化钠营养琼脂平板或试管斜面接种单个可疑菌落进行传代培养以获得纯培养物。在37C士1℃培养箱中培养24h士3h。
对氯化钠营养琼脂上的纯培养物进行鉴症7.4.2初步鉴定
7.4.2.1显微镜下检验
革兰氏染色试验：霍乱弧菌为革兰氏染色阴性，无芽孢，弧形或弯曲状；a)
b）动力试验：将可疑菌落接种一管APW，在37℃土1℃培养功h～6h。滴一滴菌悬液于一干净的载玻片上，盖上盖玻片，镜下检查细菌运动性。霍乱弧菌培养物应为运动性阳性。7.4.2.2氧化酶试验
以无菌白色滤纸蘸取营养琼脂表面纯培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。如果滤纸颜色在10 s内变为紫色或者深紫色，则为阳性反应。7.4.2.3氯化钠三糖铁试验
接种氯化钠三糖铁斜面，穿刺底层并划线斜面。37℃±i℃培养箱中培养24h士3h。反应结果解释如下：
a）琼脂底层
1）黄色：葡萄糖发醇反应阳性(发酵葡萄糖)；红色或者未变色：葡萄糖发酵反应阴性（不发酵葡萄糖)2）
黑色：产生硫化氢；
产生气泡或者培养基爆裂：葡葡糖发醇产气4）
琼脂斜面
黄色：乳糖或蓝糖阳性（利用乳糖或蔗糖）：红色或未变色：乳糖或蔗糖阴性(不利用乳糖或蔗糖)；2）
可疑的霍乱弧菌在氯化钠三糖铁斜面上的反应为底层黄色，斜面黄色，不产生硫化氢，不产气。培养应不超过24h（斜面的黄色可能在24h后变为红色）。7.4.2.4生化测试菌株选择
选择革兰氏染色阴性，运动性阳性，氧化酶阳性，氯化钠三糖铁试验符合霍乱弧菌特性的菌落在氛化钠营养琼脂平板或试管斜面纯化后，按7.4.3进行生化确认，或采用法国梅里埃公司的ID32E鉴定试剂条进行生化鉴定(按该试剂盒的操作说明进行)。7.4.3生化确认
7.4.3.1氨酸脱羧酶试验
接种鸟氨酸脱羧酶氯化钠肉汤(5.7)，在肉汤上面覆盖1mL灭菌矿物油。37℃土1℃培养24h士3h。培养后液体混浊变紫为阳性反应（细菌生长，鸟氨酸脱羧)。液体黄色为阴性反应。3
SN/T1022—2010
赖氨酸脱羧酶试验
接种赖氨酸脱羧酶氯化钠肉汤(5.8)，在肉汤上面覆盖1mL灭菌矿物油。37℃土1℃培养24h士3h。培养后液体混浊变紫为阳性反应（细菌生长，赖氨酸脱羧）。液体黄色为阴性反应。7.4.3.3精氨酸双水解酶试验
接种精氨酸双水解酶氯化钠肉汤(5.9)，在肉汤上面覆盖1mL灭菌矿物油。37℃士1℃培养24h士3h。培养后液体混浊变紫为阳性反应(细菌生长，精氨酸双水解）。液体黄色为阴性反应。7.4.3.4β半乳糖苷酶试验
挑取可疑菌落，在装有0.25mL氯化钠溶液（5.13)的试管中制成菌悬液，加人一滴甲苯，振摇试管。将试管放人37℃±1℃水浴锅中，静置5min。再加人0.25mLβ-半乳糖苷酶试剂（5.10），混勾。将试管放人37℃土1℃水浴锅中，放置24h士3h，随时观察。培养后液体变黄为阳性反应（存在β-半乳糖苷酶）。反应结果通常20min后可见。24h后无颜色变化为阴性反应。
7.4.3.5靛基质试验
将可疑菌落接种于装有5mL胰蛋白陈-色氨酸氯化钠肉汤(5.11)中。37℃士1℃培养24h±3h。培养后加人1mLKovacs试剂。形成红色环为阳性反应（形成吲哚），黄色环为阴性反应。7.4.3.6氯化钠耐受试验
准备一系列浓度的氯化钠蛋白水（5.12)，氯化钠浓度依次为：0%、2%、4%、6%、8%和10%。用待鉴定菌落的菌悬液接种每个试管。37℃土1℃培养24h士3h。观察试管中液体变混浊可知细菌能在相应的氯化钠浓度下生长。
7.4.3.70/129敏感试验
将O/129(2，4二氨基-6，7-二异丙基噪啶)为10μg及150ug的药敏纸片贴在接种有待测菌的氯化钠营养琼脂平板.37℃土1℃18h24h解育后.纸片周围任何大小的抑菌环均表现为敏感。霍乱弧菌的生化性状见表1。
生化项目
氧化酶
产气(葡葡糖)
鸟氨酸脱羧酶(ODC)
赖氨酸脱羧酶(LDC)
精氨酸双水解酶(ADH)
D-纤维二糖
D-甘露糖
阿拉伯糖
ONPG水解
42℃生长
霍乱弧菌的生化性状
生化性状
注1：+表示76%~89%或更多的菌株阳性：S表示缴感。注2：培养基中含有1%氯化钠。
注3；所有实验均不产硫化氢和气体。注4：有的非01群霍乱弧菌0%氯化钠不生长。4
生化项目
靛基质
蛋白陈水中生长
0%氯化钠
2%氯化钠
6%氯化钠
8%氯化钠
10%氯化钠
抑菌实验
10#g0/129
150#gO/129
明胶酶
尿素酶
生化性状
7.5血清学凝集试验
7.5.1血清分群试验
SN/T1022—2010
自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为O1群或0139群阳性。
与01或O139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均不凝集，且生化反应符合霍乱弧菌特性的为非01群霍乱弧菌。
与01群霍乱弧菌多价血清或0139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均凝集的，可用胰陈水大豆琼脂或脑心浸液琼脂传代，再进行凝集试验。7.5.2血清分型试验
与01群多价血清阳性的霍乱弧菌可进一步用小川型、稻叶型的单价抗血清分型：a）与小川型单价血清凝集，但与稻叶型单价血清不凝集者为小川型；b）与小川型单价血清不凝集，但与稻叶型单价血清凝集者为稻叶型；c）与小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。试管凝集试验
对玻片凝集反应不典型的苗株应做试管凝集试验。用生理盐水自1：20开始对倍连续稀释01群霍乱弧菌多价血清，每管含稀释血清0.5mL。将被检菌在营养琼脂的16h~18h培养物用0.2%甲醛生理盐水制成每毫升约含1.8X10°CFU（相当于细菌标准比浊管浓度）的悬液，每稀释血清管加入0.5mL；另将菌悬液0.5mL加人0.5mL生理盐水中作为对照。摇匀，置37℃士1℃培养3h观察初步结果。再放4℃或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明者判为十十；能使试验菌出现十十凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度。凝集滴度达到或超过血清原效价一半即确定为01群霍乱弧菌。7.601群霍乱弧菌生物分型试验
7.6.1多粘菌素B敏感试验
在胰酪陈大豆陈琼脂平板背面用玻璃笔划出若干方格。将37℃土1℃4h的被检菌肉汤培养物划线平板表面，待干后镊取50单位多粘菌素B纸片（直径6mm）置于接种区中央，倒置平板，37℃土1℃培养过夜。
古典型菌株在纸片周围呈现抑制带(10mm~15mm直径），而块尔托型菌株不受抑制或轻微抑制（6mm~7mm直径）。
7.6.2溶血试验
将24h肉汤培养物和5%红细胞盐水悬液等量混合（0.5mL或1mL）。取部分混合液在56℃加热30min做对照。另将混合物在37℃士1℃水浴中培养2h，再在4℃～5℃下冷藏过夜。检查溶血现象。必要时可低速离心后再检查有无溶血现象。多数埃尔托型菌株会造成红血球溶解。古典型及某些埃尔托型菌株不溶解红血球。因溶血素不耐热，加过热的培养物不会产生溶血。7.6.3V-P试验
接种MR-VP肉汤，22C培养18h～24h。古典型菌株为阴性。多数埃尔托型菌株为阳性或有少数阴性。
8报告结果
根据上述试验结果，表明在g或者北mL样品中检出或未检出霍乱孤菌。最终结果可进一步报告血清群别、血清型别和生物型别。检出O1，0139及非O1群霍乱弧菌的，要在24h内呈报到上一级实验室做进一步鉴定或复查，并报告相关部门。
SN/T1022—2010
A.1碱性蛋白陈水
A.1.1组成
蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
附录A
(规范性附录）
培养基和试剂\)
:1000mL
A.1.2制法
混匀后，调节pH至8.6士0.2（25℃），根据试验需要分装于广口瓶或者试管中，121℃灭菌15min。
TCBS琼脂
A.2.1组成
蛋白陈
酵母浸膏
柠檬酸钠
硫代硫酸钠
柠檬酸铁
氯化钠
牛胆盐
麝香草酚蓝
溴啤香草酚蓝
A.2.2制法
1000/mL
将各成分加热煮沸，调节pH至8.6士0.2(25℃）。不要高压灭菌。分装15mL～20mL于培养皿内制成平板。
CHROMIDVIBRIO弧菌显色培养基2)A.3.1组成
蛋白陈(牛)
肉浸膏(牛或猪）
大豆蛋白陈
氯化钠
为保证培养基的质量，应按SN/T1538.1、SN/T1538.2进行培养基的制备与性能测试。若使用商售的脱水合1)
成培养基，应选用国内外通过ISO9000质量管理体系认证生产厂商的产品并按其说明制备和使用。该培养基为法国梅里埃公司的产品。2）
碳酸钠
中性红
碳水化合物混合物
胆盐(牛或绵羊)
显色剂混合物
选择性混合物
A.3.2制法
1000mL
SN/T1022—2010
将各成分加热煮沸，调节pH8.6主0.2(25℃)。不要高压火菌。分装15mL～20mL于培养血内制成平板。
A.4氯化钠营养琼脂
A.4.1组成
牛肉浸膏
蛋白陈
氯化钠
1000mL
A.4.2制法
混匀后，调节pH至灭菌后为7.2±0,2(25℃）A21℃灵菌\\15min。分装15mL～20mL于培养血内制成平板。或者分装10 mL于灭菌试管中，倾斜放置，制成斜面A.5氯化钠三糖铁琼脂
A.5.1组成
蛋白陈
牛肉浸膏
醇母浸膏
氯化钠
柠檬酸铁
A.5.2制法
1000mL
混匀后，调节pH至灭菌后为7.4土0.2(25℃）。分装10mL于试管中，121℃灭菌15min。倾斜放置，制成斜面。
A.6氧化酶试剂
A.6.1组成
四甲基间苯二胺
SN/T1022—2010
2制法
使用前在冷水中溶解。
鸟氨酸脱羧酶氯化钠肉汤(ODC)
A.7.1组成
L-鸟氨酸
酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
氟化钠
A.7.2制法
1000mL
混匀后，调节pH至6.8±0.2(25℃)。分装2mL～5mL于小试管中，121℃灭菌15min。A.8
赖氨酸脱羧酶氯化钠肉汤(LDC)
A.8.1组成
L-赖氨酸
酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
氯化钠
A.8.2制法
1000mL
混匀后，调节pH至6.8士0.2(25℃）。分装2mL～5mL于小试管中，121℃灭菌15min。A.9
精氨酸双水解酶氯化钠肉汤（ADH）A.9.1组成
精氨酸
酵母浸膏
葡萄糖
漠甲酚紫
氯化钠
A.9.2制法
1000mL
混匀后，调节pH至6.8士0.2(25℃）。分装2mL～5mL于小试管中，121℃灭菌15min。A.10β-半乳糖苷酶试剂bzxZ.net
A.10.1ONPG溶液
A.10.1.1组成
磷硝基酚-β-半乳糖苷
A.10.1.2制法
将ONPG溶于50℃水中。将溶液冷却。A.10.2缓冲液
A.10.2.1组成
磷酸二氢钠(NaH,PO,）
氢氧化钠(NaOH)(0.1mol/L)
水，补足至
A.10.2.2制法
SN/T1022—2010
50mL容量瓶中将磷酸二氢钠(NaH,PO,)溶于约45mL水中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2(25℃），用水补足体积至50mL。A.10.3试验用混合试剂
A.10.3.1组成
缓冲液(A.10.2)
ONPG溶液（A.10.1)
A.10.3.2制法
将缓冲液加人ONPG溶液中。在0℃～5℃保存。A.11靛基质氯化钠肉汤
A.11.1.色氨酸氯化钠肉汤
A.11.1.1组成
酪蛋白陈(酶消化）
DL-色氨酸
氯化钠
A.11.1.2制法
1000mL
混匀，过滤。调节pH至灭菌后为7.0±0.2(25℃）。分装5mL于试管中，121℃灭菌15min。A.11.2Kovacs试剂
A.11.2.1组成
对二甲胺基苯甲醛
盐酸（p=1.18g/mL1.19g/mL)
2-甲基-2-丁醇
A.11.2.2制法
将3种物质混匀。
A.12氯化钠蛋白陈水
A.12.1组成
蛋白陈
氯化钠
A.12.2制法
0.20.60.80或100g
1000mL
混匀后，调节pH至灭菌后为7.5土0.2(25℃）。分装10mL于试管中，121℃灭菌15min。9
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