【国家标准(GB)】 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验

中华人民共和国国家标准
GB4789.30—2010
食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
Nationalfoodsafetystandard
Food microbiological examination: Listeria monocytogenes2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
GB4789.30—2010
本标准代替GB/T4789.30-2008《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》本标准与GB/T4789.30-2008相比，主要变化如下：-修改了标准的中英文名称；
-删除“第二法
全自动酶链荧光免疫分析仪筛选法”：-删除“第三法全自动病原菌检测系统筛选法”。本标准的附录A为规范性附录。
本标准所代替标准的历年版本发布情况为：GB4789.30-1994、GB/T4789.30-2003、GB/T4789.30-2008。I
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
GB4789.30—2010
单核细胞增生李斯特氏菌检验
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2
设备和材料
除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃~5℃。
恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。2.3均质器。
显微镜：10×~100×。
电子天平：感量0.1g。
锥形瓶：100mL、500mL。
无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。无菌平皿：直径90mm。
无菌试管：16mm×160mm。
离心管：30mm×100mm。
无菌注射器：1mL。
金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。马红球菌（Rhodococcusequi）
小白鼠：16g~18g。
全自动微生物生化鉴定系统。
3培养基和试剂
3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A.1。3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆琼脂（TSA-YE)：见附录A中A.2。3.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2)：见附录A中A.3。3.41%盐酸吖啶黄（acriflavineHCI）溶液：见附录A中A.3.2.1。1%萘啶酮酸钠盐（naladixicacid）溶液：见附录A中A.3.2.1。3.5
PALCAM琼脂：见附录A中A.4。
3.7革兰氏染液：见附录A中A.5。SIM动力培养基：见附录A中A.6。3.8
缓冲葡萄糖蛋白陈水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.75%8%羊血琼脂：见附录A中A.8。糖发酵管：见附录A中A.9。
过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。李斯特氏菌显色培养基。
生化鉴定试剂盒。
GB4789.30—2010
检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。检样
25g(mL)样品+LB，增菌液225mL，均质+
30℃±1℃,24h
0.1mL+10mLLB,增菌液
30℃±1℃，18h～24h
李斯特氏菌显色培养基
PALCAM琼脂
36℃±1℃，24h~48h
接种木糖、鼠李糖，36℃1℃，24h：同时于TSA-YE平板划线纯化，30℃±1℃，24h～48h★
木糖一，鼠李糖十
结果报告
图1单核细胞增生李斯特氏菌检验程序5操作步骤
5.1增菌
GB4789.30—2010
以无菌操作取样品25g（mL）加入到含有225mLLB，增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min~2min：或放入盛有225mLLB，增菌液的均质杯中，8000r/min~～10000r/min均质1min~2min。于30℃±1℃培养24h，移取0.1mL，转种于10mLLB,增菌液内，于30℃±1℃培养18h~24h5.2分离
取LB，二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36℃±1℃培养24h～48h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。
5.3初筛
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36℃C±1℃培养24h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24h48h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。3
5.4鉴定
GB4789.30—2010
5.4.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4μm~0.5um）×（0.5μm~2.0μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。5.4.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。5.4.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。5.4.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24h～48h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。5.4.5协同溶血试验（cAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24h～48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。5.5可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等对5.3中3个～5个纯培养的可疑菌落进行鉴定。
表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种
单核细胞增生李斯特氏菌
(L.monocytogenes)
格氏李斯特氏菌
(L.grayi)
斯氏李斯特氏菌
(L. seeligeri)
威氏李斯特氏菌
(L.welshimeri)
伊氏李斯特氏菌
(L. ivanovi)
英诺克李斯特氏菌
(L. innocua)
溶血反应
注：+阳性；一阴性：V反应不定。5.6小鼠毒力试验（可选择）
葡萄糖
麦芽糖
甘露醇
鼠李糖
七叶苷
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，于30℃±1℃培养24h，4000r/min离心5min，弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为10l°CFU/mL的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只～5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2d～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。6结果与报告
综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。4
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆肉汤（TSB-YE）A.1.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
pH 7.2～7.4
A.1.2制法
1000mL
将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。含0.6%酵母膏的胰酪陈大豆琼脂（TSA-YE)A.2
A.2.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
pH 7.2~7.4
1000mL
将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。李氏增菌肉汤（LB1，LB2）
A.3.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
七叶耆
蒸馏水
pH 7.2~7.4
1000mL
GB4789.30—2010
A.3.2制法
将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A.3.2.1李氏I液(LB)225mL中加入：1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）1%吖啶黄（用无菌蒸馏水配制）A.3.2.2李氏I液(LB2)200mL中加入：1%萘啶酮酸
1%吖啶黄
PALCAM
A.4.1成分
酵母膏
葡萄糖
七叶武
柠檬酸铁铵
甘露醇
氯化锂
酪蛋白胰酶消化物
心胰酶消化物
玉米淀粉
肉胃酶消化物
氯化钠
蒸馏水
pH7.2~7.4
A.4.2制法
1000mL
将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A.4.2.1PALCAM选择性添加剂
多粘菌素B
盐酸吖啶黄
头孢他啶
无菌蒸馏水
A.4.2.2制法
GB4789.30—2010
将PALCAM基础培养基溶化后冷却到50C，加入2mLPALCAM选择性添加剂，混勾后倾倒在无菌的平皿中，备用。
5革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
A.5.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.5.1.2制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.5.2革兰氏碘液
A.5.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.5.2.2制法
GB4789.30—2010
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.5.3沙黄复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.5.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.5.4染色法
A.5.4.1将纯培养的单个可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。A.5.4.3滴加95%乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.5.4.4滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.6SIM动力培养基
A.6.1成分
多价陈
硫酸铁铵
硫代硫酸钠
蒸馏水
A.6.2制法
1000mL
将上述各成分加热混匀，调节pH，分装小试管，121℃高压灭菌15min，备用。A.6.3试验方法
挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30℃培养24h～48h，观察结果。A.7缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用）A.7.1成分
葡萄糖
磷酸氢二钾
蒸馏水
A.7.2制法
1000mL
溶化后调节pH，分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15min，备用。7
A.7.3甲基红（MR）试验
A.7.3.1甲基红试剂
A.7.3.1.1成分
甲基红
95%乙醇
蒸馏水
A.7.3.1.2制法
10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。A.7.3.1.3试验方法
GB4789.30—2010
取适量琼脂培养物接种于本培养基，36℃±1℃培养2d～5d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A.7.4V-P试验
A.7.4.16%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法：取α-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解，定容至100mL。A.7.4.240%氢氧化钾溶液
成分及制法：取氢氧化钾40g，加蒸馏水溶解，定容至100mL。A.7.4.3试验方法
取适量琼脂培养物接种于本培养基，36℃±1℃培养2d～4d。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36℃±1℃继续培养4h再进行观察。3血琼脂
A.8.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
脱纤维羊血
A.8.2制法
5mL~10mL
除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121℃高压灭菌15min，冷到50℃，以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。糖发酵管
A.9.1成分
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)
0.2%漠爵香草酚蓝溶液
蒸馏水
A.9.2制法
1000mL
A.9.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内，8
调节pH至7.4，115℃高压灭菌15min，备用。GB4789.30—2010bZxz.net
A.9.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，115℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
A.9.3试验方法
取适量纯培养物接种于糖发酵管，36℃±1℃培养24h～48h，观察结果，蓝色为阴性，黄色为阳性。
过氧化氢酶试验
A.10.1试剂
3%过氧化氢溶液：临用时配制。A.10.2试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净试管内，，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。
3结果
于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。9
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