【农业行业标准(NY)】 食用菌菌种真实性鉴定 ISSR法

ICS 65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1730—2009
食用菌菌种真实性鉴定
ISSR法免费标准bzxz.net
Verification of genuineness for edible mushroom spawn-ISSR2009-04-23发布
2009-05-20实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A、附录C为规范性附录，附录B为资料性阴录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。NY/T1730--2009
本标准起草单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、农业部微生物肥料和食用菌案种质量监督检验测试中心。
本标准主要起草人：黄晨阳、李辉平、张金霞、陈强。T
1范围
食用菌菌种真实性鉴定ISSR法
NY/T1730—2009
本标准规定了ISSR技术鉴定食用菌菌种真实性的方法。本标雅适用于对糙皮侧耳（Pleuroius ustreatus），香菇（Lentinuta edates）、黑木耳（Auicularia uuricuta)白灵菇(Pleurntus nebrodersis)香鲍菇（Pleurotus eryngii)白黄H(Pleurotus corhurupi-ae），形侧耳（Pleurotuspuimnarius）佛州侧耳（Pleurntrsfiorictunus），灰树花（Grifotafrondosa）余菇（Flanmnttinnvelutipes）滑菇（Pholiota nameeo）茶树菇（Agroryhe cyhindrucea）、鸡腿菇（Copriruscommetus）等食用菌菌种真实性的鉴定，包括母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为不标准的条款。儿是江期的引用文件，其随所有的修改单（不包括谢误的内容）或修订版均不适用于木标，然而，鼓励根据木标准达成协议的各方研究是否可使川这些文件的最新版求。凡是不注日期的引用文件，北晟新版本适用于本标准。1Y/T1097—2006食菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶中泳法3原理
ISSR方法是以锚定微T.星DNA为[物，即衣微卫暴DNA序列的3端或5端加上2个～个随机核H履，对基因纠DNA进行PCR增，得到与错定引物h补的重复序列的区间DVA片段，不同物种基因组DXA中的这种反相重复的微卫星序列的数目和闻隔的长短不同，就可导致这些特定结合位点分布发生相放的变化，从而使PCR产物增加、减少或发生分子量的改变。通过对PCR产物的检测和比较，即可识别样本基因组INA的多态片段，从而鉴定样本的桌伪。4试剂与材料
除非见有说明，在分析中仪使用分析纯试剂和去离了水或相当纯度的水。4.170%2.醇溶液：延附录A.1。
4.21ml/LTris-HC(pH8.0).见附录A.24.30.5mol/T.艺二胺四乙酸一钠盐（EDTA)溶液：见附录A.3。4.4（TAB提取缓冲液：见附录A.4。4.5IE缓冲液：觅附录A.5
4.650×TAE缓冲液：附录A.6.
4.7加样缓冲液：见附录A.7。
4.8核酸染料，按使用说明操作。4.9苯酚一氯甲烷一异戊醇溶液-25十24十1。4.10氯甲统-异戊醇溶液=24十1
4.11无水乙醇
4.12四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTP、dGTP、dTTP)混舍溶液，4.13TaTNA聚合酶。
4.1410XPCR反应缓冲液。
NY/T 17302009
4.15DNA分子量标记。
4.16引物：参见附录13.
5仪器
5.1紫外分光光度计。
5.2高速冷冻离心机（转速不小于10000r/min）5.3高压灭阐锅。
5.4 PR增仪。
5.5电泳仪
5.6电泳槽.
5.7紫外透射仪。
5.8凝胶成像系统或照相系统。
6操作步骤
6.1DNA模板的制备
6.1.1菌丝体培养
将供检菌种与对照菌种在相同条件下培养，培养量可供做3个平行试验。采用PDA培养基配方：马铃募200g（用没IL汁），葡糖20g琼脂20名，水1000ml.，pH自然。培养条件：直径75mm或 90 mm培养血,24℃=1℃避光、隔膜培养。糙皮侧耳、白黄侧耳、肺形侧耳、佛州侧和茶树菇塔养79金针菇，鸡腿菇、白灵菇、杏婚培养9d~12d；灰树花、黑木耳、否婚和双孢蘑姑培养12d~15d。6.1.2DNA模板的制备
按照附录（：制备供检菌种、对照菌和和阴性提取对照的工NA榄板。6.2ISSR 扩增
6. 2. 1 引物
从附录B中筛选10个引物。如果必要可以筛选新的引物。6. 2. 2反应体系
PCR反应的总体积为20uL，含有1×PCR反缓冲液，0.2mmal/I.dNTP.1UTugLNA聚合酶0.1μmol/1.引物，20ng~501g模板DXA，加灭菌双蒸水至20uL，按上述比例将反应液依次妞人0.2mL离心管中，混勾，放人PCR仪中，进行PCR扩增。设置PCR牢自对照..
6.2.3反应条件
PCR扩增仪上进行以下循环：94℃预变性4min，然后$2℃变性30s，以低于引物T.值温度5℃复性455，72℃延仲2min共35个循环；72℃延伸7min,4℃保存，6.2.4PCR产物的电泳检测
将造量的琼胎糖血人×TAF缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖浓度为1.5%的溶液，待冷却至50℃60℃，加入核酸染料，混勺将其倒人制胶模其，室温下凝固后，放人装有适量的1×TAE缓冲液的电泳槽中。取PCR扩增产物和加[样缓冲液按照5+1比例混勾，点样其中一个泳道中加人DNA分厂量标记：接通电源逆行电泳。以5V/cm电压中泳，待溴酚蓝邸凝胶前缘1cm左右停止电泳。6.2.5数据记录
电泳结束后.将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。保存供检菌种与对照菌种的2
电深阁谱。
结果分析
姐果空白对照为阴性，并月3个平行试验结果一效，则本饮试验结果可以使用，NY/T 1730—2009
若供检菌种与对照菌种有显考差别.可判定供捡菌和与对照前种为不同菌种。若供检菌种与对照菌种的PCR产物一致，再增加10个引物，进行检测验证。必要时可以增加其他方法证，NY/T1730—2009
A.170%乙醇溶液
附录A
(规范性附录)
试剂的配制
玻70mL元水2醇，如水定容至103mA.21 mol/I, Tris-HCl(pR8.0)
在80mL去离子水中溶解12.11&兰释甲基氨基中烧（Tris）冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH至8.0约需.2mlL浓盐酸），加水定容至100ml,高压灭菌。A.30.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA)溶液（pIB.0)在160mI水中加人37.22g二水乙二胺四乙酸二钠EDTANa·2Hz()，在盘力搅拌器上剧烈揽拌，用氢氧化钠调节游液的pII垒8（约需4g氢氛化钠题粒），然后定容至200mL，高医灭菌.A.4CIAB提取缓冲液
在70mL去离子水巾加入8.18宫氯化钠、2g溴代十六烷基三甲胺（CTAB）2g聚乙烯吡喀烷酮(PVP)，摇动容器使溶质完全游解，然后加人10mI.」mol/TTris-HCl(pH8.0)、1mT.0.5mol/LEDTA(pII8.0)用水定容至100ml,高压灭菌。使用前加人0.1%(V/V)的β-蔬基之等。A.5TE缓冲液
在80 mL水中依饮加人1mol/L Tris HCl(pH8.0)1 mI0.5mol/L ErA(pII8.0) 0.2mL,加水定容至100ml，高灭菌。
A.650XTAE缓冲液
称取Tris242.2g先用300mL水加热搅拌溶解后，加100ml_0.5mo1/I.EDTA的水溶液（pH8.0）,用冰艺酸调H率8.0，然后用水定容到T.A.7加样缓冲液
称取溴龄蓝250mg.加水10mL，在室温下过夜溶解，再称取=H苯青FF250g，用10ml水游解；称取照糖40g，用30nl.水溶解，含并三种液：川水亲容至100mL，在4中保存，编号
附录B
(资料性附录）
试验用引物参照
常用引物
序列（53）
TGCACACACACACAC
GTGACACACACACAC
GTOACGACTCTCTCTCTCT
GGATGCAACACACACACAC
XIGIGFGTGTGTGT
AGTGTGTCTGIGTGT
CCAGTGGTEGTCCTG
GGAGTGGTGGTGGTG
AGAGAGAGAGAGAGAGG
GAGAGAGAGAGAGAGAL
GAGAGAGAGAGAGAGAAC
AGAGACAGAGAGAGAGGC
TCTCTGTCTCTCTCTCUG
ACACACACACAGACACCG
GTGTGTGIGTGTGTGTTA
TGTGTGTGTGTGTGTGGA
ACACACACACACACAC
ACACACACACACAACY
ACACACACACACACACCT
ACACACACACACACACGTG
AGCAGCAGCAGCAGCAGCG
AAGAAGAAGAAAAGAAGC
GAGAGAGAGAGAGAGAGT
CACGAGAGAGAGAGAGA
GAGAGAGAGAGAGAGACC
CACCACACACATACACA
GTATGTATGTATGTATGG
GTATGTATGTATGTATGC
NY/T1730—2D09
NY/T 1730—2009
C.1DNA的提取
附录C
（规范性附录’
DNA的提取和质量检测
C.1.1称取0.2乌菌丝，置研体中，在液氮中充分研磨成粉木C.1.2将菌丝粉未迅速转入1.5mI.离心管.加人G00uL65℃预热的CTAB提取缓冲液.C.1.3置于65℃水浴10min~60min，不吋轻轻地密动混C.1.410000t/min，离心J.0min，将上清液转移至灭菌的1.5mL离心管中，弃沉淀，C.1.5加等体积苯酚一三氯中烷一年皮醇溶液，轻轻摇与室温静置5min。C.1.6100001/min离心10min，将上清液转移至已灭菌的1.5mL离心管中，弃下层有机相C.1.7加等体积的三氯甲烷一异醇溶液，轻轻撤匀，蜜温静置5rin。C.1.8100001/min离心10min，观察分界面有无沉淀，将.1-清液转移至已灭菌的1.5mL离心管弃下层有机相。
C.1.9根据需要，上清液可用三氯中烷一异戊醇溶液提取多次直尘中间层儿明最沉淀。C.1.10加2倍体积冰冷的无水乙停，轻轻混勺，一20%沉淀20minC.1.118000r/min离心5min弃清液C1.12加70%乙醇洗涤沉淀2~3次，C1.13待沉淀-燥店.加100u.TE缓冲液，使JNA充分溶解，一20℃保存。C.2DNA质量的检测
C.2.1凝胶电泳检测
取5山上述溶液与1l.加样缓冲液混匀，任0.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像，与LA分了量标记比较，观察所提取的基因组XA质品及片段大小，若VA质量好分子量大自无降解，在点样孔附近呈现一条致密亮带：君DNA分降解.则呈现连续分布状态，若严单降解，则观察不创大片段 DNA。
C2.2紫外吸收检测
将DVA适当释释，测定并记录其在260m和280nm处的紫外光吸收率，以一个（)Dm值相当了50μg/mLDNVA浓度来计算纯化的DNA浓度。要求DNA溶液ODm/ODzgo在1.7~2.0之间。依据测得的质量浓度将DNA溶液稀释到25ng/L50ng/pI，20\C保存。注：用下基因组TDNA不自反复冻融，因此建议对！需要经常使用的TINA需要分装，多做存政，需要使用前改出，融化后应该立即使用。使用结束后，测余的NA应在4C冰箱短账保存，存放时间不完超[4
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。