【农业行业标准(NY)】 农药残留检测用丁酰胆碱酯酶

ICS65.100
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1157—2006
农药残留检测专用丁酰胆碱酯酶Butylcholinesterase for the rapid bioassay of pesticide residues2006-07-10发布
2006-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
本部分附录A为规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。NY/T1157—2006
本标准起草单位：农业部农药检定所、华南农业大学、广东省东莞市农业科学研究中心。本标准起草人：刘光学、徐汉虹、侯学文、杨晓云、廖美德、秦冬梅、何艺兵、陶传江、昊美良、江南龚勇、朱光艳、李友顺、宋稳成。I
1范围
农药残留检测专用丁酰胆碱酯酶NY/T1157—2006
本标准规定了农药残留检测专用丁胆碱酯酶的要求、实验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。本标准适用于蔬菜、水果类农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留快速检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是标注日期后的引用文件，其后所有的修改（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据标准达成协议的各方研究是否使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T448蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测方法CB/T191包装储运图示标志
3要求
3.1外观
白色至粉红色疏松粉末，不吸潮成团。3.2比活力
比活力大于或等于0.5U/mg蛋白（测定方法见附录A）。表观△A412值应大于或等于0.60。3.3定性
3.3.1SDS—PAGE(SodiumDodecylSulphate-polyacrylamidegelElectrophoresis）（型式检验项目）酶干粉溶液经SDS一PAGE后在90kD处有一明显条带。3.3.2Km值（型式检验项目）
3.3.3布比卡因抑制试验
1.5mmol/L的布比卡因抑制试验，布比卡因对酶活性抑制率大于70%。3.4稳定性
在－18℃条件下保存1年，其活力损失应小于30%。3.5敏感性
农药对丁酰胆碱酯酶的抑制率大于70%时，丁酰胆碱酯酶对农药的敏感性（农药最低检出浓度）应符合表1的规定。
酰胆碱酯酶对农药的敏感性表
农药中文名
克百威
敌敌畏
甲胺磷
氧乐果
灭多威
英文通用名
carbofuran
dlichlorovos
methamidophos
omethcate
methomay!
最低检出浓度（溶液）
(mg/L)
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3.6装量
根据酶活力测定结果分装，每支最小包装量大于24U，符合NY/T448的要求，每支最小包装量应可以测定1000个样品。
4检测方法
4.1外观
目测法
4.2酶活力测定与计算
见附录A。
4.3比活力
见附录A。
4.4定性
4.4.1 SDS-PAGE
见附录 B。
4.4.2Km值
见附录 C。
4.4.3布比卡因抑制试验
见附录D。
4.5酶稳定性测定
见附录E。
4.6酶敏感性测定
见附录F。
4.7蛋白含量测定
见附件G。
5检验规则
5.1组批和抽样
以相同工艺流程在同一时间制备的酶产品为一批次。在同批次产品中以随机抽样的方式抽取至少3支样品供检。
5.2出厂检验
产品出厂前，应由生产厂的检验部门按本标准规定逐批进行外观、比活力检验。检验合格后，出具合格证并在包装箱内（外）附有签署质量合格证的产品方可出厂。5.3型式检验
型式检验对产品进行全面检验，即对本标准规定的全部要求进行检验。一般每半年进行一次。有下列情况之一者亦应进行：a）更改主要原辅材料或更改关键工艺：b）长期停产后，恢复生产时；
c）国家质量监督部门提出进行型式检验要求时。5.4判定原则
5.4.1出厂检验
外观，比活力如有不符合本标准时，对不合格项目从该批货中加倍抽样复检。复检结果仍有一项不2
符合本标准，则判定该批产品为不合格。5.4.2型式检验
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除外观、比活力外，其他型式检验项目中有一项不合格，即判定该批产品不合格。6标志、包装、运输、购存
6.1标志
6.1.1产品包装上应标明产品名称、酶活力，制造者的名称和地址、生产日期、保质期，产品标准号、贮存条件、单位产品数量。
6.1.2每支（单位）产品上应标明产品名称、酶活力、制造者名称6.1.3储运图示的标志应符合GB/T191的有关规定和图示。6.2包装
酶产品密封包装。内、外包装材料应符合卫生要求，不易受压变形。6.3运输
6.3.1运输工具应清洁、卫生。不应与有害、有毒、有腐蚀性、易挥发物品混装运输。6.3.2运输过程中应保持低温状态，快装快运。防止日晒、受潮、挤压，轻拿轻放。6.4存
6.4.1产品不得与有害、有毒、有腐蚀性、易挥发物品同库贮存。6.4.2产品应贮存在-18℃环境中，注意防潮。6.5保质期
符合贮存条件下，产品有效期为一年。e
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A.1酶活力测定原理
附录A
(规范性附录）
酶活力测定方法
依据Ellman法，硫代丁酰胆碱（BuTC）在丁酰胆碱酯酶（BuChE）作用下，被水解成硫代胆碱和丁酸，硫代胆碱可与二殖双对硝基萃甲酸（DTNB）反应生成黄色产物，该产物在波长412nm处有最大吸收峰，因此可在此波长下进行比色，测定酶活性。反应过程如下：(CH)NCHCHSCOCH,CHCH+H,O
(CH)NCHCHSH+NO
BuTChE
(CH)NCHCHSS
A.2酶活力单位
(CHNCHCHSH+CHCH.CHCOOH
NO2+HS
NO（黄色）
在37C，0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液条件下，每分钟分解1umol碘化硫代丁酰胆碱为一个酶活力单位(U)。
A.3试剂配制
A.3.1磷酸缓冲液：准确称取磷酸氢二钠（NazHPO,·12H.O）33.92g，磷酸二氢钠（NaH,PO4*2HO）0.83g溶解后定容至1000mL即为pH8.00.1mol/的磷酸缓冲液。A.3.2丁酰胆碱酯酶液：根据酶活性情况按要求用0.1mol/L的PH8.0磷酸缓冲液溶解，反应前后吸光度差值△A控制在大于或等于0.4之间。A.3.3碘化硫代丁酰胆碱（BuTCI）溶液：取100mgBuTCI溶于10mL上述pH8.0磷酸缓冲液中，即为碘化硫代工酰胆碱(BuTCI)溶液。A.3.4二硫代双对硝基苯甲酸（DTNB）溶液：取60mgDTNB溶于10mL上述PH8.0磷酸缓冲液中。A.4测定步骤与计算
取A，B两支试管，分别加人0.1mol/pH8.0磷酸缓冲液3.0mL，加人丁酰胆碱酯酶液50L和二硫代双对硝基苯甲酸（DTNB）溶液50μL，置于（37±1）t水浴中保温15min~30min（根据室温的不同调整水浴时间）后，于A试管中加人0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液50L，作为标准液调零；B试管加人50μL碘化硫代丁酰胆碱（BuTCI)溶液，混匀后立即倒入玻璃比色杯中比色，记录3min前后的吸光值变化值，记为AA412值。每一酶液重复测定3次，取平均值（AA412）进行分析。酶活力单位数计算公式A1为：
AA412-V
酶活力单位数(U)=
式中：
反应前后A412吸光度的差值；
反应体系总体积，本体系为3.15×10-3L；黄色产物摩尔吸光系数，为1.36×10+L（mol·cm）-1一比色皿光程，单位为厘米(cm）；T—反应时间，本法T为3min；
摩尔换算为微摩尔的换算系数。比活力计算
根据酶活力单位数及蛋白含量，可得酶的比活力。计算公式如A.2：活力单位（U)
比活力（U/mg）=
蛋白质量数（mg）
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NY/T1157-—2006
B.1材料与仪器
B.1.1化学试剂
丙烯酰胺
甲叉双丙烯酰胺
十二烷基苯磺酸钠
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
巯基乙醇
考马斯亮蓝
甘氨酸
蛋白分子量标记
B.1.2仪器
电泳系统
试剂配制
30%丙烯酰胺贮备液
丙烯酰胺
甲叉双丙烯酰胺
用蒸增水定容至100mL
22×上样缓冲液
Tris-Cl(pH6.8)
溴酚蓝
巯基乙醇（临用前加人）
B.2.3浓缩胶缓冲液
1mol/LTris-Cl(pH6.8)
B.2.4分离胶缓冲液
1.5mol/LTris*CI(pH8.8)
5电极缓冲液（g/L）
附录B
（规范性附录）
SDS-PAGE
【SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳】
100mmal/L
4%(w/g)
20%（w/g）
5%(v/)
甘氨酸
染色液
考马斯亮蓝G-25
冰醋酸
脱色液
B.3方法与步骤
0.25%（w/v)
45%（/）
10%（/)
甲醇（v）：冰醋酸（v）：水（v）=75：50:375B.3.1准备好玻璃板，用乙醇擦净，蒸增水冲洗，并按照仪器要求安装好电泳槽。B.3.2配制不连续电泳凝胶：浓缩胶5%：分离胶12%。配方如下（单位mL）：浓缩胶
30%丙烯酰腰溶液
1.5mol/LTnsCl(pH8.8)
0.5mol/LTris.Cl(pH6.8)
10%SDS
10%过硫酸铵溶液
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分高胶
先配制分离胶溶液，加人两玻璃板之间，避免产生气泡，并加人正丁醇覆盖凝胶表面隔断空气，以利于凝胶聚合；
B.3.3分离胶聚合后，倾去正丁醇，用蒸馏水冲洗干净；配制浓缩胶溶液，注入到分离胶上端，插入梳子，避免产生气泡；B.3.4
离胶；
待凝胶合后，拔出梳子，冲洗点样孔，将凝胶放人电泳槽中，加人电极缓冲液，上槽液漫过分电泳样品的准备：将等体积的待测样品液与2×上样缓冲液混合，置于沸水中，沸水浴5min；按次序，用微量注射器在点样孔内加人适量体积的电泳样品；B.3.7
上样完毕后，接通电源，开始电泳。电泳时，在浓缩胶内控制电流在10mA；分离胶内控制电流B.3.8
在30mA。直到溴酚蓝距分高胶底部5~10mm时，断开电源；B.3.9取下凝胶，做好标记，将凝胶置于装有0.25%考马斯亮蓝染色液的平盘中，染色4h~5h；B.3.10染色结束时，取出凝胶，蒸馏水冲洗后，置于装有脱色液的平盘中，振荡脱色，更换脱色液直到电泳条带清晰为止；
B.3.11观察结果，用凝胶成像扫描仪分析、照相记录。7
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C.1试剂配制
同附录A.1项。
测定步骤
附录C
（规范性附录】
Km值测定
取两个石英比色杯，一个作空白对照，一个用来测定，依次按照下表加人底物和磷酸缓冲液，样品杯中加人酶液，按照A.1的方法操作，每30s读数一次，共3min～5min，测定每个底物浓度下t~AA412关系曲线，根据曲线线形部分的斜率计算反应初速度o（μmol/L/min），取u和底物浓度的倒数，作底物浓度对u的双倒数曲线，直线的横截距为-1/Km，纵截距为1/V（最大反应速度），计算出Km值。表C-1不同底物浓度配比表
BuTCI浓度，mmol/L
10mg/mlBuTCI溶液，L
0.1mol/LpH8.0的磷酸缓冲液，mL6mg/mlDTNB游液
薄液，μL
D.1试剂配制
1.5mmol/L布比卡因溶液；
其余试剂配制同A.1。
D.2测定步骤
附录D
【规范性附录】
布比卡因抑制实验
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取AB两支试管，A管加人0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液3.0mL为对照管，B管加人1.5mmol/L布比卡因3.0mL，然后分别加人50L酶液，50L二硫代双对硝基苯甲酸（DTNB）溶液，置于37C水浴15min~30min后再分别加人50L碘化硫代丁酰胆碱（BuTCI）溶液，混匀后立即倒人玻璃比色杯中比色，记录3min前后的A值，每一标准农药浓度重复测定3次，取4A平均值进行分析。抑制率按D.1式计算：
抑制率（%）=4-AAs×100
式中：
AAc—对照管3min后与3min前吸光值之差：AAs样品管3min后与3min前吸光值之差。(D.1)
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E.1试剂配制
同附录A.1。bZxz.net
测定步骤
附录E
（规范性附录
酶稳定性测定
按照附录A规定的方法测定酶活力，再按E.1式计算酶活力损失率。酶活力测定值
产品中酶活力标示值）×100
酶活力损失率（%）=（1-
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