【农业行业标准(NY)】 饲料中安眠酮的测定 高效液相色谱法

ICS 65.120
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1463—2007
饲料中安眠酮的测定
高效液相色谱法
Determination of methaqualone in feedsby high-performance liquid chromatography2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准由中华人民共和国农业部提出。前言
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口NY/T1463-2007
本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测武中心（济南）、农业部饲料质量监督检验测试中心(西安)：
本标准主要起草人：烫文利、任爱丽、粱屿、徐强陈淑沂、忽桂香。1范围
饲料中安眠酮的测定，高效液相色谱法NY/T 1463 2007
本标准规定了用高效液相色谱仪(HPLC)测定研料中安眠删的检测方法。本标准适用于配介饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料的检测。方法的定室限为1.号g/k，检测限为 0. 5 mg/ kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括期误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标雅，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1料采样
3原理
在碱性条件下，用三氮中烷和异丙厚的混合溶液将饲料中的安眠酮提取山来；将提取液蒸至近干，用甲醛溶解残渣，在HPLC上分离、测定。4试剂bzxZ.net
除非另有说明，在分析仅使用确认为分析纯的试剂。水符合GB/T6682中一级水和三级水的规定。一般化学分析用三级水，高效液相色谱分析用一级水：4.1乙腊：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3碳暧钠饱和溶液。
4.4氯化钠。
4.5提取液：异丙醇—三氮甲烧=1+3.4. 6乙酸铵溶液：c(CH:CCXONH,）-25mmol/L,雅确称取1.927g乙酸铵于1000mL容量瓶中,用一级水溶解、定容，用d0.45um的水相微孔滤膜过滤，4.7TIPIL.C流动相：乙(4.1)--乙酸铵溶液（4.6)=30「70,用前超声脱气5min、4.8安眠酮标准购各溶液（100μg/mL)：准确称取10.1mg安眠酮标准品（=99.0%）于100mL容量瓶中，用甲醇（4.2)溶解、定容。置于4℃冰箱小保存，有效期1个月4.9安眠酮标准工作溶液：分别准确移安眠酮标准则备溶液（4.8)1.00mL：3.00mL.5.00ml]100ml:容量瓶中，1.00mL、2.00mL，3:0DtmL、5.00mL于10mL容量瓶中，用醇稀释、定容，配制成标准工作溶液，质量浓度分别为1.00ng/1L、3.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/1.、20.00mg/L、30.00ng/ L,50. 00 mg/ L。现用现配。5仪器
5.1实验室用梓品粉碎机
5.2分析天平：感量0.1mg。
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5.3离心机：1360×g
5.4超纯水器。
5.5超声波清洗器。
5.6旋涡混合器。
5.7带盖塑料离心管：100ml.
5.8旋转蒸发仪.
5.9高效液相色谱仪，市下述部件组成：5.9.1泵：无脉冲,能将流速保持在U,1 ml./min~2. 0 ml,/min。5. 9. 2进梯系统+进样环休积20 gL~50 uL..5.9.3紫外检测器，适合在波长226nm测定。如可能可使用管阵列检测器，其还能用丁安眠酮的确证。
5.9.4T作站。
5.9.5保护柱：柱长12.5mm，内径4.Gmm，填有粒度为5um的C：键合硅胶或质量相当的其他保护柱，
5.9.6分析柱：社长250mm内径.6mm.填有粒度为5jum的C链合硅胶柱或性能相当的其他分析杜
分析杜的性能应确保以下条件：安眠酮的容量闲了K
注:容量因子按式(1)计算：
式中：
容量四子：
安眠酮的保留时间.单位为分钟（min)：不保留成分的保留时间,单位为分创(min)。6试样的制备
接GB/14699.1的规定进行采样：选取具有代表性的实验室择品1000g：用四分法缩减分取200g左右：粉碎过0.15mm孔径的筛：充分混匀.装入磨口瓶中备用。7分析步骤
7.1提取
称取约2g试料，精确到0.1mg放人离心管(5.7)中，加人化纳(4.4)2g，加人15ml.三级水用碳酸钠饱和溶液（4.3）调pI至10~11.加人20mL提取液（4.5).轻探数砂：加盖密封：旋涡（5.6）混勾数秒，放气：旋涡混勺30s两次：离心机（5.3）离心5min；吸取下层溶液十具塞试管中：再加人提取液20㎡L，重复上述操作，合并两次提取液.旋涡混匀。全部转移到100mL鸡心瓶中，在50%下用旋转蒸发仪（.8）蒸发至近十，5.001L.甲醇溶解残渣，旋涡氓勾，使辫液中安眠酮的质量浓度在1.00mg/L～50.001n1g/工之间。否则·需要更新调整溶液的释倍数。用Φ0.45μm的有机微孔滤膜过滤，在高效液相色谱仪(5.9)上进行分离、测定。7.2 HPLC 分析
7.2.1色谱条件
流动相流速：1.C0 mL/1i1;
逃样量：20 uL；
检测波长：226nm
7.2. 2分析程序
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7.2.2.1向HPLC分析仪连续注大安瞩酮工作液（4:9），直至得到基线平稳；峰形对称而且峰高或峰面积能够重现的安眠酮峰，即个连续测定的峰高或峰面积中最大与小值之闻的差异小于其平均值的5%.
安眠酮峰应是对称的（Fa,<2)。注：f.为安喉酮峰峰高105处;尾十部降宽与前半部峰宽之商，：。两个安眠啊作没所得色谱峰峰高与浓度之间应有正比例关系。如果偏差大于5%，则需制备新的工作额，
7.2.2.2依次注人安眠工作液（4.9）、五个试伴溶液（7.1)和安眠酮T作液（4.9）.观察工作液的峰高或峰面积差导不得超过均值的5%。可依此顺序不断加人待测样品，8确证
8.1总则
如果从峰形、测定数值对眠雨的峰产生了怀疑，或所测定安眠酮含量低于1.5mg/kg，则应用重叠色谱分析(8.2)或二极管阵列检测器(8.3)来确证。8.2重叠色谱法
于样品提取液中加人适量的安眠酮工作液（1.9)，加的量应与提取滚中安眠酮的量相当。依次注人样品提取液、安眠酮工作液和添加了安眠剧的样品提取液。如果添加提取液释品峰的半峰宽变化不大于10%，且峰高或峰而积发生了成比例的变化，则可确证原安眠酮峰就是安眠酮的。8.3极管阵列检测器
8.3.1条件
測定条件同7.2.1的规定，只是将紫外检测器换为二极管阵列检测器，其体参数如下：参数
测定波长
带宽度
参比波长
参比频带宽度
光谱范围
光谱值
8.3.2步骤
226iitn
4 mr即波K 226 nm—2 mm)
190 um~400 rum
基线、峰最大值、上升斜率和下降斜率拐点HPLC系统稳定后，依次注入10.00Hg/mL的安眠酮工作液（1.9）有凝问的样品提取液和又10.00码/ml.的安瞩酮工作液（4.9)。记录、存储各个色谱峰的基线、最大慎以及峰两侧的扔点激据。8.3.3评价
将样品峰不同光谱值（样品一基线)归一化并绘制成图，记录峰值和峰前后的拐点值。分别将样品峰光谱和安眠酮工作液的光谱归一化，并绘图。在峰顶处标示。8.3.4确证标准
样辟峰只有满足下述条件，才能证实是安眠酮：）样品峰的保留时间应与标准峰的保留时间相同（差异≤一5%），如有怀疑，需做标准物添加（即将标准物加到样品中)实验。
b）样品峰的纯度评定是基」所记录的峰项、上升斜率拐点和下降斜率拐点不同光谱的符合程度3
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所有光谱图微个波长的相对吸收值应该相等（差异15%）。波长大于220nm.样品光游图与标准光谱图在相对吸收至少等]：10%的部分尤明显区别，样品峰和标准峰的最大吸收波长相同，即其差异不大丁检测系统分辨率决定的范围（一般是2址n~-4m，两个光谱图任：观察点的偏差均不能超过该特定波长下标准测定物吸收值的15元。
9结果计算
通过比较试样溶液色谱峰的蜂高或峰而积和在样品前后注人的安眠酮工作液的峰高或峰面积的平均值定量。
饲料中安喉的含量X，以克每干克(1g/kg)表示，按式(2)计算：Fixexy
式中：
P安瞩酮试样溶液峰面积的响应值；Pa-
安眠酮标准工T作溶液峰面积的响应值：安眠翻标准工作溶液的浓度，单位为毫克每升（m/I)；V-试样溶液的体积,单位为毫升mL)试料的质量，单位为克(g)。
每个试样取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果，结采保留一位有效数字，10
重复性
在同实验室，由同一操作人员，用同一台仪器完成的两个平行测定结果，相对相差小于8%。(2)
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