【商检行业标准(SN)】 小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1943—2007
小麦中转基因成分PCR和
实时荧光PCR定性检测方法
Protocol of polymerase chain reaction and real-time PCR for qualitativedetecting genetically modified components in transgenic wheat2007-08-06发布
数码防伪
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-03-01实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标
小麦中转基因成分PCR和
实时荧光PCR定性检测方法
SN/T1943-2007
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880X1230
2007年11月第一版
印张0.75
字数16千字
2007年11月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066：2-18225
定价8.00元
本标准的附录A为规范性附录。
本标准出国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1943-2007
本标准由中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中国检验检疫研究院负责起草。本标准主要起草人：案凤侠、张洪祥、白月、高勇、黄文胜、徐宝梁本标准中如涉及国内已申请的专利，专利持有人声明放弃在中国境内的使用。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1
1范围
SN/T1943—2007免费标准bzxz.net
小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法本标准规定了小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR检测方法。本标准适用于小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR的定性检测，2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SN/T1193基因检测实验室技术要求SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本标准
转基因transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过分子生物学手段导人·使其在该物种中表达，以便该物种获得新的性状特征。3.1.2
mponent
转基因成分geneticallymodified com物种本身不具有的、而足来源于其他物种的功能基因列。3.1.3
endogenous referencegene
内源基因
在转基因作物基因组中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的，在其他品种作物中不存在的基因，该基因即可用丁评价样品中是否存在该作物品种，也可作为参照基因序列对某一目的基因进行定量检测.同时还可确定DNA提取是否成功、并验证PCR反应体系中是否存在抑制物质。3.1.4
外源基因exogenousgene
利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。3.2缩略语
下列缩略语适用于本标准。
3.2.1bar:phosphinothricinacctyltransferasegenefromBacillusamyloliguefacions，来源于杆菌Bacillusamyloliquefacions草丁麟乙酰转移酶基因3.2.2Ct：cyclethreshold，每个反应管内的荧光信号达到设定阅值时经历的循环数3.2.3GAG56D:triticmaestivumpartialGAG56Dgeneforgamma-gliadin，小麦醇溶蛋白基因（GeneBank编号：Gl：10538295）。是小麦属特异性内源基因。3.2.4NAC:noamplifieationcontrol.阴性对照SN/T1943—2007
3.2.5NOS：terminatorofnopalinesnthasegenefromAgrobucteriumtumefaciens，来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。
3.2.6NTC：notemplatecontrol，空白对照。3.2.7Ubiquintin：玉米泛素蛋白基因启动子3.2.8uidA：betaglucuronidase(GUS)reportergenefromE.coli，大肠杆菌转β-葡糖苷酶基因3.2.9
Wxo12：wheatwaxinessgene，小麦蜡质基因，是小麦物种特异性内源基因。4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。5抽样和制样
5.1抽样
按照SN/T1194中规定的方法执行。5.2制样
称取约20g小麦样品，在粉碎机中研磨至样品成粉末。6方法提要
样品经过提取DNA后，针对转基因小麦内外源基因所设计的引物和探针序列，分别通过PCR和实时荧光PCR技术，特异性扩增内外源基因的DNA片段，并根据PCR和实时荧光PCR检测结果，判断该样品中是否含有转基因成分。7试剂
除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。7.1CTAB裂解液：3%CTAB（质量分数），1.4mmol/L氯化钠，0.2%（体积分数）统基乙醇，20mmol/L,EDTA,100mmol/LTris-HCl.pH8.o。7.2TE缓冲液（pH8.0)：量取10mL1mol/LTris-Cl(pH8.0)和2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加水定容至1000mL，分装后高压灭菌备用。7.310XPCR缓冲液：100mmol/L氯化钾（KC1)，160mmol/L硫酸铵[（NH,）SO.J，20mmol/L硫酸镁（MgSO,),200mmol/L.Tris-HCl(pH8.8),1%TritonX-100,1mg/mLBSA。7.4氯化镁。
7.5dNTP：dATP、dTTP.dCTP、dGTP、dUTP。7.6
TagDVA聚合酶。
三氯甲烷。
7.8异戊醇。
异丙醇。
70%乙醇。
RNaseA:2mg/uL。
引物和探针：根据附录A中表A1、表A.2的序列合成引物和探针，加超纯水配制成10oumol/L储存，用于PCR测试的引物浓度为10umol/L。7.13
溴化乙锭：10.mg/mL。
7.14DNA：分子量标记100bp~2000bp。7.15
5琼脂糖。
7.1650×TAE缓冲液：称取484gTris，量取114.2mL冰乙酸200mL0.5mol/L.EDTA（pH8.0），2
溶于蒸馏水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用7.17：10×上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF.30%甘油水溶液。7.18PCR反应缓冲液。
7.19UNG醇。
8仪器
基因扩增仪。
电泳仪。
电泳槽。
凝胶分析成像系统。
紫外可见分光光度计。
天平：感量1mg.0.1mg。
高压灭菌锅。
超低温冰箱。
冷冻离心机。
水浴锅。
微波炉。
微量加样器：2.5L，10μ20μL，100μl.200uL,1000lPCR反应管：200L，500μL两种规格。Eppendorf离心管：1.5mL，2.0ml。实时荧光定量PCR仪。
超净工作台
超纯水器。
漩涡振荡器。
检测方法
小麦基因组DNA的提取
9.1.1CTAB法
SN/T1943-2007
称取0.2g粉碎后的小麦样品于2mL离心管中.加入1mLCTAB裂解液.混匀，65℃水浴保温30min，不时振荡：12000r/min离心5min；小心取离心上清液，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积分比24：1)混勾.静止5min，12000r/min离心5min：取离心上清液，再加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积比24：1）混匀，静止5min，12000r/min离心5min：取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混勾，12000r/min4℃离心10min：奔上清液，加500μL70%冰乙醇洗涤一次，12000r/min4℃离心5min；弃上清液.将沉淀晾干.加人50uLTE，溶解沉淀（4℃过夜，或37℃保温1h）；4℃保存备用。每个实验室样品应制备两个测试样品和提取空白对照同时提取DNA：9.1.2试剂盒法
小麦总DNA的提取也可使用相应市售DNA提取试剂盒。9.2核酸纯度和浓度的定量
样品中提取的DNA做适当稀释，放人紫外分光光度计的比色杯中，于260nm处测定其吸收峰，1ODasnmm=50μg/ml.双链DNA或38μg/ml单链DNA。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2μg/mL~50μg/mL，OD值应该在0.05~1范围内。PCR级DNA溶液的ODmm/ODasomm的比值为1.72.0。SN/T1943—2007
9.3质控设置
阴性对照（NAC)：以非转基因小麦DNA为模板阳性对照：采用含有月的基因序列的转基因小麦DNA为PCR反应的模板，或采用含有目的基因序列的质粒，
空白对照（NTC)：PCR试剂空白对照（以水代替PCR模板）提取空白对照。9.4PCR定性检测
9.4.1PCR反应体系和反应参数
PCR反应体系和参数见附录A中表A.3、表A.4。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。每个反应体系应设置两个平行反应。9.4.2PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量10×TAE稀释成1×TAE溶液-配制溴化乙锭含量为0.5ug/mL的1%~2%琼脂糖凝胶。取10μLPCR产物，加2μL上样缓冲液·在琼脂糖胶孔内点样：用DNAMarker.判断PCR产物的片段大小。电压根据电泳槽长度来判断.一般控制在3V/cm~5V/cm长度，电泳时间根据漠酚蓝的
移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶分析成像系统记录9.4.3PCR结果判定
9.4.3.1小麦DNA提取液是否适合PCR扩增判断用小麦内源Wx012（或GAG56D)基因对小差DNA提取液进行PCR测试，阴性对照，阳性对照和测试样品都应该被扩增出102bp（或628bp）的PCR产物如未见有PCR扩增，则说明在DNA提取过程中木提取到可进行PCR测试的DNA，或DNA提取液中有抑制PCR反应的物质存在，应重新提取DNA，直到扩增出该PCR产物。
9.4.3.2小麦中转基因成分检测
对小麦样品DNA提取液进行外源基因的PCR检测、如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，扩增片段大小见附录A中表A.1).则可初步判断有可疑阳性和测试样品均出现预期大小的扩增条带（的该外源基因，应进一步做实时荧光ICR等确证实验，然后依据确证实验结果最终报告。如果测试样品中未出现PCR扩增产物.则可判定测试样品中不含有该外源基因。9.4.4确证实验
样品检测为阳性结果时需要用实时荧光PCR来确证9.5实时荧光PCR定性检测
9.5.1实时荧光PCR反应体系及反应参数实时荧光PCR反应体系和参数见附录A中表A.5反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。每个发应体系应没置两个平行反应9.5.2实时荧光PCR结果判定
9.5.2.1实时荧光PCR质控标准
空白对照：无荧光增幅现象：
阴性对照：无荧光增幅现象：
阳性对照：外源基因检测Ct值小丁或等于36。上述指标有项不符合者·应重新作实时荧光PCR扩增。9.5.2.2实时荧光PCR结果判定
测试样品内源基因检测Ct值小于或等于36.外源基因检测C1值大于或等于40，判断该样品不含所检的外源基因。
测试样品内源基因检测Ct值小于或等于36，外源基因检测Ct值小于或等于36，判断该样品含有所检的外源基因。
测试样品外源基因检测CL值在3640之问，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后4
SN/T19432007
的外源基因Ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品检出X××基因。再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品未检出×××基因
9.6结果表述
该样品未检出×X基因。
该样品检出义×X基因。
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被检测基因
ubiquitin
GAG56D
附录A
（规范性附录）
小麦中转基因成分PCR定性检测方法参照表表A.1
定性PCR检测小麦内外源基因所需的引物序列基因来源
小麦属内源
小麦种内源
引物序列
5'-gaateeigttgecggtcttg-3
5'-ftatetaglttgegcgcta-3
5'-gtegcaccatcgtcaacc-3
5'-gaagtrcagetgccagaaac-3
5'-acagcacggtcaactc-3
5'-eteggcegtecagtegta-3'
5'-agtgtacgtatcaccgt1igtgigaae35'-atcgecgettggacataceatcegia35'-aacactggcaagitagcaat3
5-ccgtaataaatagacacce-3
5'-cccacaacaaccacegitca3
5'-tggccctggacgagagtucct-3
5'-gtcgcgggaacagaggtgt.3
5-ggtgttceiccatgcgaaa-3
ubiquitin只可用于不含卡米成分的多组分小麦样品和单一组分小麦样品的筛选基因表A.2实时荧光定性PCR检测小麦内外源基因的引物和探针序列被检测基因
GAG56D
ubiquitin
基因来源
小麦属内源
小麦种内源
引物序列
5'-caacaattttefcagcccceaca-35'-1tegcatgggtteactgtt3
5'-gtcgcgggaaeagaggigt-3
5'-gggtteetecatigcgaaa-3\
5'-acaageacggtcaac1tee-3
5-acrcggccgrccagtcgta-3
5'-gtccagaggcagcgacagi-3\
5'cgagtagataaigecagecgtta-3
5'-utcgttcaaacarnggca-3
5'-atgcggactetaareata-3
探针序列
5'-1teccgcagceceaicaiccge-3
5'-caaggcggcegaaartagttgcc-35-ccgagcegeaggaacegcaggag-3
5'-tgcegtgecgicigcttegettg-35'-catcgcaegiccggcacugg-3'
注：探针的5端标记FAM荧光报告基团.3端标记TAMRA等荧光泽灭基团ubiquitin只可用于不含玉米成分的多组分小麦样品和单一组分小麦样品的筛选基四扩增长度/bp
扩增长度/bp
试剂名称
10XPCRBuffer
氯化镁（MgCl）
引物（上游、下游）
Tag酶
DNA模板
表A,3小麦内外源基因定性PCR检测的反应体系储备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
10pmol/μl
5U/μL
0.3μg/μL~6pg/μL
SN/T1943—2007
加入体积/L
补足总体积为25L
注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整表A.4小麦内外源基因定性PCR检测的反应参数被检测基因
ubiquitin
GAG56D
预变性
94℃.5min
94℃C.3min
94℃.5min
95℃.10mir
94℃.5min
94C.30s:58℃40s:72℃.1.5mim
94℃.20s:54C.40s:72T.1min
94℃.imin:62℃.1min：72℃.1.5min94℃.30s:54C.305;72C.1min
95C.30s:63℃.30s:72℃.30s
94℃.30s：61℃.lmin：72℃.1.5min注：PCR反应循环参数可根据基因扩增仪器型号的不同进行适当调整。表A.5
试剂名称
循环数
实时荧光PCR定性检测小麦内外源基因的反应体系和反应参数终浓度
10XPCR Buffer
氯化镁（MgCl）（25mmul）
dNTP含dUTP)(2.5mmol)
UNG酶(U/μ）
上游引物（10pmol/L）
下游引物（10pmol/l）
探针（mol/L）
Tae醇(5U/L)
DNA模板
补水至
2.5mmol/L
0.2mmol/L
0.2pmol/μL
0.2pmol/μl
0.2pmol/μl
50ng/μel
加入体积（pL）
后延伸
72℃.10min
72℃.3min
72℃,10min
72℃.10min
72t.10min
补足水至25
SN/T1943—2007
试剂名称
反应参数
二步法（适合ABI仪器）
三步法（只适合LighrCycler仪器）表A5（续）
终浓度
加人体积(μL)
预变性95℃/3min1个循环：95℃/15s，60℃/605，40个循环预变性95℃/10min.1个循环95℃/5s.50℃/5s，60℃/20s，40个循环注1：实时荧光PCR建议最好使用市售real-timePCR专用试剂，反应体系和反应参数可直接参考试剂盒说明书。
注2：不同型号仪器的使用可直接参考仪器使用操作说明。注3：当外源基因和内源基因标记相同的荧光报告基团时，应在不同反应管中分别加入外源基因和内源基因的引物、探针，分别进行检测。
注4：DNA模板的加入量可适当调节。合适的DNA模板量应该是：内源基因检测的Ct值在15～36之间，外源基因检测的Ct值在27～36之间。否则应进一步增加/减少或纯化DNA。注5：表中给出的PCR反应体系和反应参数可很据仪器要求的不同进行适当调整。书号：155066：2-18225
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