【国家标准(GB)】 化学品急性经皮毒性试验方法

ICS _13. 300; 11. 100
中华人民共和国国家标准　
GB/T21606-2008
化学品急性经皮毒性试验方法
Test method of acute dermal toxicity for chemicals2008-04-01发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-09-01实施
GB/T21606—2008
本标准修改采用联合国经济合作与发展组织（OECD)化学品测试方法No.402《急性经皮裘性试验》（1992.7)（英文版）。
本标准与OECD化学品测试方法No.402相比，存在以下差异：一对OECD化学品测试方法No.402进行了编辑性修改；—增加了前言部分；
增加了附录部分。
本标准的附录B、附录D为规范性附录；附录A、附录C为资料性附录。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标准参加起草单位：天津市检验检疫科学技术研究院、河南省职业病防治院。本标准主要起草人：吴维、李朝林、侯粉霞、林铮、孙金秀、李霜、张圆、于智睿、李宁涛、刘涛。I
1范围
化学品急性经皮毒性试验方法
GB/T21606-2008
本标准规定了动物急性经皮毒性试验的试验目的、试验基本原则、试验方法、试验结果评价、试验报告和结果解释。
本标准适用于评价化学品的急性经皮毒性。2术语和定义
急性经皮毒性acutedermaltoxicity受试样品一次或在24h内多次经皮肤染毒所产生的健康损害效应。2.2
经皮半数致死剂量dermalmedianlethaldose一次或在24h内多次经皮肤染毒受试样品，引起受试动物发生死亡概率为50%的剂量，以单位体重接受受试样品的质量[mg/kg或g/kg]来表示。2.3
剂量-反应关系dose-responserelationship表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。3试验目的
确定受试样品能否经皮肤吸收和短期经皮染毒所产生的急性毒性作用和强度，并为确定亚急（慢）性经皮毒性及其他试验的剂量设计提供试验依据。4试验基本原则
在试验前，先去除实验动物受试部位的被毛。将实验动物分成若干剂量组，每组涂布不同剂的受试样品，而后观察实验动物中毒反应和死亡情况，计算LD5o。对试验中死亡的动物做大体解剃和病理组织学检查，对试验结束时的存活动物也应做大体解剖。注意排除受试样品引起的皮肤局部刺激或腐蚀作用所致的全身效应。
5试验方法
受试样品处理
不溶性或难溶固体或颗粒状受试样品应研磨，过100目筛。用适量无毒无刺激性赋形剂混匀，以保证受试样品与皮肤良好的接触。常用的赋形剂有水、植物油、凡士林、羊毛脂等。液体受试样品一般不必稀释，可直接用原液试验。
5.2实验动物
首选大鼠，也可选用豚鼠或家免。实验动物体重要求范围分别为：大鼠200g～300g，豚鼠350g～450g，家兔2000g~3000g。
试验期间，为避免实验动物相互抓挠，应尽可能采用单笼喂养。试验前24h，在动物背部正中线两侧去毛，仔细检查皮肤，要求完整无损，以免改变皮肤的通透性。去毛面积不应少于实验动物体表面积的10%。各类动物体表面积的数值和计算方法见附录D。1
GB/T21606—2008
5.3剂量和分组
实验动物随机分为4～5个剂量组。若使用水、植物油、凡士林、羊毛脂以外的赋形剂和溶剂，则需设赋形剂对照组。豚鼠或大鼠每一剂量组（单性别)不少于5只；家免每一剂量组（单性别)最好为5只。各剂量组间要有适当的组距，可按等比或等差级设置剂量，以使各剂量组实验动物产生的毒性反应和死亡率量现剂量-反应关系。
一般情况下，如果剂量达到2000mg/kg仍不出现实验动物死亡时，则不需要再进行进一步试验。5.4试验步骤
选择适当方法固定好实验动物，将受试样品均匀涂布于实验动物的去毛区，并用塑料薄膜或玻璃纸和两层纱布覆盖，再用无刺激性胶布或绷带加以固定，以保证受试样品和皮肤的密切接触，防止脱落和动物舔食受试样品。24h后取下固定物和覆盖物，用温水或适当的溶剂洗去皮肤上残留的受试样品。5.5观察期限及指标
观察并记录染毒过程观察期内动物中毒和死亡情况。观察期限般为14d，全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及毒特点和毒作用的靶器官，观察指标见附录ALDso的计算见附录B。对死亡动物进行户检。观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖，必要时，进行病理组织学检查。6试验结果评价
按附录B计算LDsol/可按附录C相应的分级原则进行7试验报告
7.1受试样品名称期化性状、配制方法\\所用浓度等。7.2体内试验需包括：实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）性别体重范围和/或周龄、眼养方式；实验动物饲养环境，包括均料来源（对非标准饲料应注明饲料的配方）、室温、相对湿度，动物实验室和饲料的合格证号；剂盘设计和动物分组方法，每组所用动物性别、数量及初始体重范围。7.3主要操作步骤
7.4各项检测指标的测定方法及主要检测仪器的名称和型号。7.5按剂量组列表说明酶组动物数、性别状况、出现毒效应的动物数、死亡动物数。7.6染群时间、染毒持续时间、染群后动物中毒的主要表现。7.7LDso计算方法。
7.8LDso值及其95%可信区间包括雌、雄实验动物各自的LDso）。7.9病理组织学检查结果。
7.10结论。
8结果解释
经皮LDso是评价化学物急性毒性的重要参数之一，也是急性毒性分级的依据。但LDso仅表示受试样品经皮吸收引起实验动物死亡50%的剂量，并不能全面反映受试样品经皮吸收的所有急性毒性特征，因此，评价一受试样品经皮急性毒性既要考虑其对某一品系实验动物的经皮LDso值，又要考虑其中毒症状表现及反应出现的早晚和持续时间，并结合体重变化与病理学检查结果，经综合分析才能得出经皮急性毒性较为全面的评价。
附录A
(资料性附录）
啮齿类动物中毒表现观察项目表啮齿类动物中毒表现见表A.1。
表A.1啮齿类动物中毒表现观察项目表器官系统
中枢神经系统及
躯体运动
自主神经系统
呼吸性质
心血管系统
胃肠系统
生殖泌尿系统
皮肤和毛皮
观察及检查项目
各种刺激的反应
大脑及脊髓反射
肌肉张力
髓孔大小
呼吸性质和速率
心区触诊
粪便硬度和颠色
阴户，乳腺
会阴部
颜色，张力
完整性
透明度
直肠或皮肤温度
一般情况
中毒后一般表现
改变姿势，叫声异常，不安或呆滞GB/T21606—2008
颤，运动失调，麻痹，惊厥，强制性动作易兴奋，知觉过敏或缺乏知觉
减弱或消失
强直，迟级
缩小或放大
流涎，流泪
流鼻滞
徐缓，困难，潮式呼吸
心动过缓，心律不齐，心跳过强或过弱气胀或收缩，腹泻或便秘
粪便不成形，黑色或灰色
发红，皱折，松弛，皮疹
流黏液,充血，出血性紫结,苍白溃疡
上险下垂
眼球突出或震颤
降低或升高
姿势不正常，消瘦
GB/T21606—2008
B.1霍恩氏(Horn)法
B.1.1预试验
附录B
（规范性附录）
化学品急性毒性试验LDso（LCso）计算方法可根据受试样品的性质和已知资料，选用下述方法：一般多采用-0.1g/kg、1.0g/kg和10.0g/kg的剂册，各以23只动物预试验。根据24h内死亡情况，估计LDso的可能范围，确定正式试验的剂量。也可简单地采用一个剂量，如215mg/kg，用5只动物预试验。观察24h内动物的中毒表现。如症状严重，估计多数动物可能死，即可采用低于215mg/kg的剂量系列，反之症状较轻，则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的效献资料时可不进行预试验。B.1.2动物数
一般每组用5只
B.1.3常用剂量系列
因为剂量间距较
述剂量系列设计5
时容易得出结果。
B.1.4正式试验
t=0，±1，±2，±3
计0,士1,生2，士3为小，所以结果较为精确。十般试验时，可根据上
组，即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这样在查表将动物在动物实验饲养观察3d～5d，使其适应环境，证明其确系健康动物后，进行随机分组。给予受试样品后一般规察14d，必要时延长到28d记录死亡数，查表（表B.1)求得LDs，并记录死亡时间及中毒表现等。
B.1.5该方法的优缺点
优点是简单易行，节省动物：缺点是所得LDso的可信限范围较大，不够精确/但经多年来的实际应用与验证，同一受试样品与寇氏法所得结果极为相近。因此对其测定的结果应认为是可信与有效的。表B.1
组1组2组3组4
需感氏法(Horn)LDso值计算(剂量递增法测定LD%/计算用表）剂量1=0:464
剂量2=1.00×10
剂量3=2.15
剂量4=4.64
95%可信限
1.37~2.91
1.23~3.24
1.05~2.78
0.951~2.27
0.926~1.71
1.01~2.91
剂量=1.00
剂量2=2.15×10m
剂量3=4.64
剂盘4=10.0
95%可信限
2.95~6.26
2.65~6.98
2.27~5.99
2.05~4.88
2.00~3.69
2.17~6.28
剂量1=2.15
剂量2=4.64×10°
剂盘3=10.0
剂量4=21.5
95%可信限
6.36~13.5
5.84~10.8
5.70~15.0
4.89~12.9
4.41~10.5
4.30~7.94
4.67~13.5
组1组2组3
剂量1=0.464
剂量2=1.00×10
剂量3=2.15
剂量4=4.64
表B.1(续）
剂量1=1.00
剂量2=2.15×10*
剂量3=4.64
剂量4=10.0
95%可信限
0.862~2.50
0.775~2.05
0.741~1.57
0.740~2.14
0.665~1.75
1.22~3.14
1.07~2.43
1.05~1.70
1.06~3.60
0.866~3.01
0.737~2.41
0.661~1.83
0.818~3.19
0.658~2.70
0.550~2.20
0.523~2.32
0.806~2.67
0.674~1.92
0.839~4.29
0.616~3.50
0.466~2.77
0.573~3.76
0.406~3.18
1.18~3.26
1.27~2.05
0.978~3.92
0.893~2.92
1.37~2.91
1.26~2.33
1.23~3.24
1.05~2.78
0.951~2.27
0.926~1.71
1.01~2.91
0.862~2.50
0.775~2.05
0.741~1.57
0.740~2.14
0.665~1.75
1.22~3.14
95%可信限
1.86~5.38
1.69~4.41
1.60~3.99
1.59~4.62
1.43~3.78
2.63~6.76
2.31~5.24
2.26~3.65
2.29~7.75
1.87~6.49
1.59~5.20
1.42~3.95
1.76～6.37
1.42~5.82
1.19~4.74
1.13~4.99
2.16~7.71
1.74~5.76
1.45~4.13
1.81~9.23
1.33~7.53
1.00~5.98
1.24~8.10
0.875~6.85
2.74~4.42
2.11~8.44
1.92~6.30
2.95~6.26
2.71~5.01
2.65~6.98
2.27~5.99
2.05~4.88
2.00~3.69
2.17~6.28
1.86~5.38
1.69~4.41
1.60~3.99
1.59~4.62
1.43~3.78
2.63~6.76
GB/T21606-2008
剂1=2.15
剂量2=4.64×10
剂量3=10.0
剂盘4=21.5
95%可信限
4.00~13.5
3.60~9.50
3.44~7.30
3.43~9.95
3.08~8.14
5.66~14.6
4.98~11.3
4.87~7.87
4.94~16.7
4.02~16.7
3.42~11.2
3.07~8.51
3.80~14.8
3.05~12.5
2.55~10.2
2.43~10.8
4.66~16.6
3.74～12.4
3.13~8.89
3.89~19.9
2.86~16.2
2.16~12.9
2.66~17.4
1.89~14.8
5.46~15.1
5.90~9.53
4.54~18.2
6.36~13.5
5.70~15.0
4.89~12.9
4.41~10.5
4.30~7.94
4.67~13.5
4.00~13.5
3.60~9.50
3.44~7.30
3.43~9.95
3.08~8.14
5.66~14.6
GB/T21606-2008
剂量1=0.464
剂量2=1.00×10
剂量3=2.15
剂量4=4.64
表B.1（续）
剂量1=1.00
剂量2=2.15×10*
剂量3=4.64
剂量4=10.0
95%可信限
1.07~2.43
1.05~1.70
1.06~3.60
0.866~3.01
0.737~2.41
0.661~1.83
0.818~3.19
0.658~2.70
0.550~2.20
0.523~2.32
1.00~3.58
0.806~2.67
0.674~1.92
0.839~4.29
0.616~3.50
0.466~2.77
0.573~3.76
0.406~3.18
1.18~3.26
1.27~2.05
0.978~3.92
0.893~2.92
95%可信限
2.31～5.24
2.29~7.75
1.87~6.49
1.59~5.20
1.42~3.95
1.76~6.37
1.42~5.82
1.19～4.74
1.13~4.99
2.16~7.71
1.74~5.76
1.45~4.13
1.81~9.23
1.33~7.53
1.00~5.98
1.24~8.10
0.875~6.85
2.53~7.02
2.74~4.42
2.11~8.44
1.92～6.30
剂量1=2.15
剂量2=4.64×10
剂量3=10.0
剂量4=21.5
95%可信限
4.98~11.3
4.87~7.87
4.94~16.7
3.42~11.2
3.07~8.51
3.80~14.8
3.05~12.5
2.55~10.2
2.43~10.8
4.66~16.6
3.13~8.89
2.86~16.2
2.16~12.9
2.66~17.4
1.89~14.8
5.46~15.1
5.90~9.53
4.54~18.2
4.14~13.6
表B.2用于每组5只动物，其剂量递增公比为101/2，意即10×101/2=31.6，31.6×101/2=100，，余此类推。此剂量系列排列如下：1.00
t=0,±1,±2,±3
霍恩氏法（Horn)LDso值计算（剂量递增法测定LDso计算用表）组4
剂盘1=0.316
剂量2=1.00×10
剂册3=3.16
剂量4=10.0
95%可信限
1.60~4.95
1.41~3.55
1.36~5.84
1.08~4.64
0.927~3.41
0.891~2.24
1.01~4.97
剂量1=1.00
剂量2=3.16×10
剂量3=10.0
剂量4=31.6
95%可信限
5.07~15.7
4.47~11.2
4.30~18.5
3.42~14.7
2.93~10.8
2.82~7.08
3.19~15.7
表B.2（续）
剂量1=0.316
剂量2=1.00×10
剂量3=3.16
剂量4=10.0
95%可信限
0.801～3.95
0.682~2.93
0.638~1.97
0.636~3.14
0.542~2.32
1.11~3.80
1.07~2.21
1.10~6.82
0.806~5.23
0.632~3.75
0.537~2.48
0.740~5.70
0.534~4.44
0.408~3.27
0.378~3.53
1.01~6.77
0.723~4.37
0.554~2.65
0.768~8.87
0.484~6.53
0.318~4.62
0.434~7.28
0.259~5.67
1.27~5.88
1.43~2.94
0.968~7.75
0.843~5.00
0.833~2.85
0.896~8.37
0.711~5.93
0.604~3.92
0.568~2.35
0.555~4.27
0.463~2.88
0.953~7.15
1.03~3.06
0.658~10.4
0.528~5.98
0.442~3.32
0.594~11.5
0.423~7.48
剂量1=1.00
GB/T21606—2008
剂量2=3.16×10″
剂3=10.0
剂量4=31.6
95%可信限
2.53~12.5
2.16~9.25
2.02~6.24
2.01～9.92
1.71~7.35
4.26~17.6
3.51~12.0
3.40~6.98
3.48~21.6
2.55~16.5
2.00~11.9
1.70~7.85
2.34~18.0
1.69~14.1
1.29~10.3
1.20~11.2
3.18~21.4
2.29~13.8
1.75~8.39
2.43~28.1
1.53~20.7
1.00~14.6
1.37~23.0
0.819~17.9
4.03~18.6
4.53～9.31
3.06～24.5
2.67~15.8
2.63~9.01
2.83~26.5
2.25~18.7
1.91~12.4
1.80~7.42
1.76~13.5
1.47~9.10
3.01～22.6
2.08~32.7
1.67~18.9
1.40～10.5
1.88～36.3
1.34~23.6
GB/T21606—2008
寇氏(Korbor)法
预试验
表B.2（续）
剂量1=0.316
剂量2=1.00×10
剂3=3.16
剂量4=10.0
95%可信限
0.305~4.80
0.276~5.33
0.539~10.4
0.446~3.99
0.307~18.3
0.187~9.49
0.26221.4
0.137~13.0
1.19~5.71
0.684~9.95
0.723~4.37bzxz.net
0.558~12.2
0.484~6.53
0.467~3.14
0.434~7.28
0.356~4.12
0.793~7.10
0.333~16.9
0.303~5.87
0.244~23.1
0.172~10.3
0.148~12.1
剂量1=1.00
剂量2=3.16×10*
剂量3=10.0
剂量4=31.6
95%可信限
0.966~15.2
0.871~16.8
1.70~33.0
1.41~12.6
0.970~58.0
0.592～30.0
0.830~67.8
0.433~41.0
3.77~18.1
2.16~31.5
2.29~13.8
1.76~38.6
1.53~20.7
1.48~9.94
1.37~23.0
1.13~13.0
2.51~22.4
1.05~53.4
0.958~18.6
0.771~73.0
0.545~32.6
0.467~38.1
除另有要求外，一般应在预试中求得动物全死亡或90%以上死亡的剂量和动物不死亡或10%以下死亡的剂量，分别作为正式试验的最高与最低剂量。2动物数
除另有要求外，一般设5～10个剂量组，每组6～10只动物为宜。B.2.3剂量
将由预试验得出的最高、最低剂量换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差，按所需要的组数，分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。B.2.4试验结果的计算与统计
B.2.4.1列试验数据及其计算表
包括各组剂量（mg/kg，g/kg），剂量对数（X），动物数（n），动物死亡数(r），动物死亡百分比（p，以小数表示），以及统计公式中要求的其他计算数据项目。8
B.2.4.2LDso的计算公式
GB/T21606-2008
根据试验条件及试验结果，可分别选用式(B.1)～式(B.3)中的一个，求出logLDso，再查其自然数，即LDso(mg/kg，g/kg)。
B.2.4.2.1按本试验设计得出的任何结果，均可用式(B.1)：logLDso=1/2×(X;+X+)(P+-P.)
式中：
X与Xi+及P+与P:
分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比。B.2.4.2.2按本试验设计且各组剂量对数等距时，可用式(B.2)：logLDso=XK-1/2×(P:+P+)
式中：
XK———最高剂量对数,其他同式(B.1)。.(B.1)
B.2.4.2.3若试验条件同2.4.2.2且最高、最低剂量组动物死亡百分比分别为100(全死)和0(全不死时），则可用简便计算式(B.3)。logLDse =XK-d(ZP-0.5)
式中：
各组动物死亡百分比之和，其他同式（B.2）。B.2.4.3标准误与95%可信限
B.2.4.3.1logLDso的标准误(s)计算见式(B.4)。slogLDso= d([P;(i-P,)J/n)1/2B.2.4.3.295%可信限(X)计算见式(B.5)。X=log(logLDso±1.96slogLDso）·（B.3)
·（B.4)
.·（B.5)
此法易于了解，计算简便，可信限不大，结果可靠，特别是在试验前对受试样品的急性滤性程度了解不多时，尤为适用。
B.3概率单位-对数图解法
B.3.1预试验
以每组2～3只动物找出全死和全不死的剂量。B.3.2动物数
一般每组不少于10只，各组动物数量不一定要求相等。B.3.3剂量及分组
一般在预试验中得到的两个剂量组之间拟出等比的六个剂量组或更多的组。此法不要求剂量组间呈等比关系，但等比可使各点距离相等，有利于作图。B.3.4作图计算
B.3.4.1根据各剂量组动物死亡率，从表B.3中查各组的概率单位。因死亡率为0%和100%的概率单位，与所试动物数有关，故需另在表B.4中查找。例如：对死亡率为45%的概率单位，可查表B.3。先在表的左侧纵标目上找到40，而后在表的上行横标目处找到5，两者交叉点处的4.87，即为45%的概率单位。又如：某组用10只实验动物，如果全部存活（死亡率为0%），查表B.4，其概率单位为3.04。B.3.4.2用方格纸绘散点图，横轴表示剂量的对数值（X)，纵轴为概率单位值(Y），将各组数值点在图上。
B.3.4.3按各点的分布趋势，用直尺绘出一条最适合于各点的直线，使线上方的点到线的总距离与线9
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