【国家标准(GB)】 饲料中恩拉霉素的测定 微生物学法

ICS 65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T21542-—2008
饲料中恩拉霉素的测定
微生物学法
Determination of cnramycin in feeds-Microbiological method2008-04-09发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-07-01实施
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。言
本标滩印全国简料工业标雁化技术委员会虹口：本标准起罩单位：上海市兽药饲料监察所本标准丰婴起草人：顾欣、蔡金华、刘雅妮、沈富林、士蓓、黄上新、金凌艳YKAONIKAa
GB/T 21542--2008
1范围
饲料中恩拉霉素的测定微生物学法本标准规定了饲料中恩拉霉素的微生物学测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中恩拉霉素的含量测定。本力法测定简料中恩拉霉素的定量限为0.5mg/kg（500U/kg）2规范性引用文件
GB/T 21542—2008
下列文件中的条款通过本标雅的引用而成为本标推的条款，凡是注用期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于不标准！GB/T6682—1992分析实验用水规格和试验方法（neqIS0)3696：1987）(B/T20195动物饲料试样的制备（IS0)6198.1998,IDT）中华人民共和国兽药典（2005年版－部）3术语和定义
下列术语和定义适用于本标雅，3.1
恩拉霍泰效价单位potency unitof enramvcin微生物学法测定的恩拉霖素生物活性单位用U表示。1mg恩拉需素相当于1(00U4原理
用酸性甲醇溶液提取试样中的恩拉霉素，然后提取液用大孔吸附树脂对恩拉霉素吸附、洗脱，除去饲料中的扰物质。利用标准液中恩拉霉素浓度的对数与其对敏感微生物生长抑制而产生的抑菌圈的直径成正比关系的原制作标准曲线，根据试样液中恩拉舒素产生抑菌圈的大小米测定饲料中恩拉霉素的含量。
5试剂和材料
除另有规定外，在分析中使用的试剂均为分析纯，永为蒸馏水或去离子水，应符合GB/T66821992规定的三级用水要求。5.1甲醇溶液
甲醇-水(1+-1）。
5.2盐酸溶液
取盐酸 9 mL,加水至 1 000 mL,混勾5.3熟氧化钠溶液
敢澄清的氢氧化钠饱和溶液112mL，加水至1000mL，混勾，5.4洗涤液此内容来自标准下载网
甲醇溶液（5,1).用氢氧化钠溶液（5.3)调节pH值至8.1
GB/T 21542-2008
5.5提取液
甲醇溶液(5.1),用盐酸溶液(5,2)调节pH值至3。5.6洗脱液
甲醇-水(7+3)，用盐酸溶液（5.2)调节pH值至3。5.7灭菌水
按附录A的规定制备。
5.8磷酸盐缓冲液(pH 6.0)
按附录A的规定制备。
5.9大孔吸附树脂
多孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物树脂（Amberlite XAD-2,粒度：20目～60目，平均孔径：9nm，比表面积：300m/g，孔容积：0.65mL/g，骨架密度：1.08g/mL，25℃）。可使用参数柏同的同类产品：将备使用的大孔吸附树脂浸入足量的甲醇中（液面高出树脂层 2 cm～5 cm）,轻轻地搅拌，使充分混合，放置15 min，小心地尽量倾去上层甲醇液，加入足量的水，搅拌混合，放置10 rnin，备用。5.10大孔吸附树脂层析柱
将预处理过的大孔吸附树脂(5. 9)混法装入层析柱中(高 20 cIn,内径 10 Mm)，使柱床高度为15 cm,使用25 mL洗漆液(5. 4)以 0. 4 mL/min流速过柱,平衡庐待用。5.11思拉霉素标准溶液
5.11.1恩拉霉素标准贮备溶液
称取恩拉霉素标推品（效价单位不小于900 U/m名)适鼠，精确至 0.1 mg,用甲醇溶液(5.1)解并稀释成含思拉霉素1000U/tmL的溶液,在0℃～4℃可保存7d。5.11.2恩拉霉素标准工作溶液
精确量取恩拉露素标准贮备溶液(5.11.1),用 PH6.0磷酸盐缓冲液（(5.8)稀释成0、4U/mL0.8 U/mL、1. 6 U/mL3. 2 U/mL、6,4 U/mL浓度的标准工作溶液。以 1. 6 U/mL 为中心浓度标准工作溶被。
5. 12培养基 I
按附录A的规定制备。
5.13培养基Ⅱ
按附录A的规定制备。
5.14试验菌种
枯草芽孢杆菌(Barussmbs)[CMCC(B)6350或CVCC717]。5. 15菌悬液
取枯草芽孢杆菌(5.14)的新鲜培养物接种于培养基1（5.12)内,在 35℃~37℃培养7d,用灭菌水将穿孢洗下，在 65℃C水浴加热30 min后，于 3 000 1/min离心30 min,弃去.L层液,加入足量的灭菌水使沉淀物重悬浮，离心，重复洗涤三次，弃去洗液，最后加人适量的灭菌水制成菌悬液，此菌悬液在0 ℃～4 ℃可保存 6个月。
5.16双碟的制备
取培养基Ⅱ（5.13)加热融化，冷却至60C，加人适量的菌悬液（以1.6U/ml中心浓度标准工作溶液产生的抑菌阁直径不小于16mt为宜），摇匀。每个双碟加入10mL含菌培养基，均匀摊布，放置于水平操作台上冷却，待培养基凝固后，在每个双碟内半径为2.8cm的圆周上等距离放置6个已灭菌的不锈钢小臂。
6仪器与设备
6.1分析天乎:感量0.0001g。
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6.2天平：感量 0.01 g。
6.3振荡器：往复式。
6.4离心机。
6.5旋转真空蒸发器。
6.6电热恒温水浴锅：温度波动士1℃。GB/T 21542—2008
6.7平底双碟：首径为90 m1.高16mrn～1？mm，符合《中华人民其和国兽药典》2005年版，-部的要求。
6.8陶瓦盖。
6.9不锈钢小管：高 10.0 mm士0.1 mm,外径8.0 mm上0.1 mm,内径6.0 mm土0.1 mm,符分中华人民共和国兽药典》2005年版一部的要求。6.10温培养箱：温度波动±1℃。6.11高压灭菌锅
6.12可调式微量移液器:200μL～1000μL6.13游标卡尺(精度0.02 mtn)或抑菌圈测定仪7试样的制备
按GB/T20195制备试样，经粉碎后全部通过11m孔筛，混匀，装人密闭容器中备用。8含量测定
8.1标准曲线的制备
取制备好的双碟(5.16)平均分为5组，标难工作溶液（5.11.2)衔一个浓度为-组，每组不少于3个碟子，每个双碟的6个不锈钢小管中，问位的3个使用可调式微量移液器滴加200）±1.中心浓度标准工作溶液（5.11.2)，另外3个滴200μ1.该组浓度标雅工作溶液，将双碟小心移至恒温培养箱中，盖上淘瓦盖,于 36 ℃.-37 ℃培养 16 h～18 h。测量各组中心浓度标准工作溶液和该组标准工作溶液的抑菌阐直径，分别计算平均值，再计算所有双碟中心浓度标准工作溶液抑菌圈直径的总均值，作为修正值。各浓度组的抑菌圜直径按式(1)修正：A, = B. -B+A
武中：
A,—-一该浓度标准工作溶液被修正后的抑菌圈直径；B修正：
B--·该浓度组中心浓度标准1作溶液所至抑菌圈直径读数平均值；A——该浓度标难工作溶液抑菌圈直径读数平均值，..(1)
以各组溶液浓度的对数与该组溶液被修正后的抑菌圈直径作线性回归，求出回归方程。相关系数r应不小于0. 99。
8.2试样溶液的制备
8.2.1推确称取10g的试样，精确0.01多，置于250ml.具塞饿形瓶内，加入50.0mL提取液（5.5），摇列，调节pH至3.使用往复式振荡器报荡30min，转移至100mL离心管中，30001/mi11离心10 min，取上清液过滤，将滤液用氢氧化钠溶液(5,3)调节pH至88.2.2最取20.0mlL滤液，以0.6nL/min的流速经过大孔吸附树脂层析柱（5.10），再用12ml洗涤液(5.1)以0.1 ml./min的流速过柱,洗涤去除杂质。然后用40 ml.洗脱液(5.6)以0.2nL/min的流3
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速过柱,收集洗脱液。
8.2.3将洗脱液用旋转真空蒸发器于45℃蒸干，加人适量的甲溶液（5.1)于蒸发瓶中，溶解残渣，定容(使溶液中的恩拉霉素浓度在 0.4 U/ml.~6.4 U/mL-之间)制成试样浴液。8.3测定
取与标准曲线同时制备的至少3个双碟（5.16)，按标准曲线的制备方法（8.1)分别滴加试样溶液（8.2)和中心浓度标准工作溶液，与标准曲线同时操作和培养。9判定与结果计算
9.1判定
试样溶液不产尘抑菌圈，判定饲料中恩拉素为阴性。试样溶液产生抑菌圈，判定饲料中恩拉霉素为阳性并计算含量。9.2结果计算
用回归方程求出中心浓度标准工作溶液对应的抑菌图直径作为修正值，按式(1)校正试样溶液抑菌圈直径数的平均值，再用回归方程求出试样溶液中恩拉每素的实测浓度（c），饲料中感拉霉素的含量X，以效价单位每千克(U/kg)表示，按式(2)计算：X=×1000
式中：
试样溶液中虑拉霉素的实测浓度，单位为效价单位每毫升(U/mL）；V—提取液的体积数，单位为毫升（mL)；提取液过柱后的浓缩数；
试样的质量，单位为克(g)。
测定结果用平行测定的算术半均值表示，保留至三位有效数字。10复性
由同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于15%。4
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A.1培养基 I
A.1.1成分
蛋白陈
牛肉浸出粉
氯化钠
A. 1. 2 制法
附录A
（规范性附录）
培养基及溶液的配制
1 000 ml.
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除琼脂外，混合上述成分，调节 pH值比最终pH值略高 0,2~0.4，加入琼脂，加热溶化后过滤，调节 pH 值使灭菌店为 f. 510. 1,分装丁试管中,于 121 C灭菌 15 min。制成斜面备用，A.2培养基Ⅱ
A.2.1成分
蛋白陈
牛肉浸出粉
氯化钠
磷酸氢二钠
A.2.2制法
I oot ml
除琼脂外,混合上述成分，调节 pH值比最终 pH值略高0. 2~0.4,加人琼脂,加热溶化后过滤，调节pH值使灭菌后为8.0土0.1.分装于锥形瓶巾，于121℃灭菌15min。A.3磷酸盐缓冲液(pH6. 0)
A.3.1成分
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
A.3.2制法
1 000 ㎡L
将上述各成分于水中溶解.分装于锥形瓶中，丁121℃灭菌15min。A.4灭菌水
将水分装于锥形瓶中，于12！℃灭菌15 min。5
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中华人民共和
国家标准
饲料中思拉霉素的测定
微生物学法
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开本 880×1230 1/16
印张 0. 75字数 11 千字
2008 年 5 月第一版
2008年5月第一-次印刷
书号：155066·1-31414定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究
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