【医药行业标准(YY)】 一次性使用医用手套生物学评价要求与试验

ICS 11. 140. 01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T 0616--2007
一次性使用医用手套
生物学评价要求与试验
Medical gloves for single use--Requirements and testing for hiological evaluation(FN455-3:2000,MOD)
2007-07-02发布
国家食品药品监督管理局
2008-03-01实施
YY/T 0616—2007
2规范性引用文件
3术语和定义
4要求．
5试验方法
6试验报告
用改良LoWTy分析法测定天然橡胶手套水溶性蛋白质的方法附录A（规范性附录）
附录B(资料性附录)
医用手套可溶出蛋白质和过敏原的免疫学測定方法附录C（资料性附录）高效液相色谱法(IIPLC)测定氨基酸(AAA）.附录口（资料性附录）术语·
参考文献
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本标准修改采用EN455-3：2000%--次性使用医用手套第3部分：生物学评价要求与试验》，与EN455-3：2000无技术性差异，仅将引用的欧洲标准和药典改为我国相应标准和药典，本标推的附录 A 是规范性附录,附录 B,附录 心和附录 D 均为资料性附录。本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会提出并归口：本标准起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心。本标准主要起草人秦冬产、黄经春，由少华、吴平。1
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最近几年，常有报道胶乳产品由于含有胶乳蛋白质使医护人员和病人产生不良反应，由于化学物质、润滑剂、灭菌残留物（环氧乙烷）、致热物等残留物产生的不良反应也在科学文献中有所捕述。其中报道最多的是天然橡胶胶乳手套产生不良反应，但其他聚合物制成的手套也可以引起一些不良反应。GB/T16886标准给出了有关医疗器械生物学评价指南，并包括了特定试验和其他涉及安全性规范的试验方案。
本标准未涉及使用医用手套所产生的全部不良友应（如速发型超敏反应），存在于手套中的特异性过敏原会引发这些不良反应，导致这些反应的因素有：a）长期，高频佩带手套；
皮肤与黏膜直接与过敏原（又称变应原）接触，特别在皮肤与黏膜有损伤的情况下接触过敏原h)
或吸入微粒；
c）常年使用手套，手套紧密贴敷皮肤。本标推给出了用以评价医用手套生物学安全性的试验方法,作为YY/T 0316 风险管理过程的一部分。
本标准有规定胶乳蛋白质利化学物质的可接受水平，因为在这一领域有关安全性评价因素（如过敏原的识别、致敏作用阅和过程控制等)尚不十分清楚。随着对其认知的不断提高，预期本标准将会被修订。目前进一步测定和控制这些过敏原的试验方法还处于研究之中。1范围
一次性使用医用手套
生物学评价要求与试验
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本标准规定了一次性使用医用于套生物学安全性评价的要求，给出了标示和手套包装的要求以及所用试验方法的信息。本标准还包括用于可溶出蛋白质和过敏原测定的免疫学试验方法综述。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T16886、1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T 16886.1-2001,ISO 10993-1:1997,IDT)
GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5—2003，ISO 10993 5:1999,IDT)
(GB/F16886.7医疗器械生物学评价第7部分：环氧乙烷灭菌残留康（GB/T16886.7—2001，ISO 10993-7:1995,1DT)
GB/T16886,10医疗器械生物学评价第10部分：刺激与退发型超敏反应试验(GB/T16886.10—2005，ISO 10993-10:2002,IDT)
GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12—20051S0 10993 12:2002,IL)I)
YY/T0316医疗器械风险管理对医疗器械的应用（YY/T 0316—2003，IS014971-1:2000IDT)
中华人民共利国药典二部（2005年版）3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
化学物质chemuicals
生产过程的任何工序中或贮存期间添加或形成的物质，包括润滑剂、化学涂层和灭菌剂·这些物质可从最终产品中检出。
内毒素endotoxins
来源于革兰氏阴性菌细胞膜外层结构的脂多糖。注：内毒素来源于原材料.生产过程中的工艺用水和手工处置过程中的细菌污染。3.3
可溶出蛋白质leachableproteins从最终产品中落出的不同分子量的水溶性蛋白质和肽。注：蛋白质主要来源于天然橡胶胶乳。萤白质和其他可能添加的蛋白质会在生产过程中发生变性和降解，水中没提出的蛋白质可引起1型过嫩反应。1
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热原pyrogens
使家免发热的物质，这些物质也能使人体产生发热反应和其他不良反应。注：内毒素是热原的一种。
过程限值processlimit
生产过程中可能产生的最高蛋白质含量。4要求
4.1总则
一次性使用医用手套应按B/T16886进行评价，并应按照YY/T0316进行风险分析。4.2可溶出蛋白质
制造商应按5.1规定的法监测含天然橡胶胶乳成品手套中可溶出蛋口质的过程限值。若有要求，应能提供试验结果利所
月的试验方法
本标准与风险分析相结合，用以确定污染物和残留物所涉及的生物学风险是否可以接受。4.3内毒素
如果手套标示“低因声素含量”制造商应接，2规烂的方法监测无菌手套内毒素污染。有这种标示的手套，每副手套的内毒素含量应不超过20EUS
4.4化学物质
手套应不含有限会滑石粉（硅酸镁）。有要求，制造商应说明生产过程中添加或产品中已知存、抗氧化剂和柔菌剂等依据现有文献资料已知对健康有不良影响的物质。在的化学成分，如促
4.5标示
除了其他相关是的标示要求之外包装上至少还应给出下刻内容：由天然橡胶胶乳制成的医用手套应有以下文字或等效貌明。a
“(产品）合
起过敏反应的天然像胶胶乳。”b）有粉手套应
下文字或等数说明
“注意：手术前血用无菌操作法去除表面粉末，以使组织不良反应的风险降至最小。”注，该注意事项可在内包装物上给出制造商如标示合有金真质，应给出按5.1规定测定的过程限值；注1：不充许标示蛋度质量低于50μg/g。注2：尚未确定对胶乳过敏的使用这种手套的安全性。d）不应标示“低变应原性
注：注意YY04662003给出的特号。5试验方法
5.1可溶出蛋白质
测定可溶出蛋白质的方法应采用附录A给出的改良Lowry法，或经与改良Lowry法比对确认过的方法，详见附录A，
注1：现有确认过的用于可溶出蛋白质分析的其他方法（如附录C给出的确认过的氨基酸分析法），只要能证明这些方法经过确认，并与本标准规定的标准方法有对应关系就允许采用，但这些方法不适合用于常规质量控制。注2：蛋白质免疫学测定法还处在发展过程中（参见附录B）。5.2内毒素
除非鲨试剂(LAL)试验中出现无法排除的干扰现象，对方法的选择、确认和使用应符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）规定的细菌内毒素检查法或具有相同灵敏度和重现性的LAL试2
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验方法。LAL试验中如出现无法排除的十扰，不能准确测出细菌内毒素水平，这种情况下可以采用中1国药典》中规定的兔热原试验。LAL试验结果应表示为每副手套含内毒素单位(EU)每批产品都应进行试验。推荐的手套最小检验意根据批量确定。批量少于30副时，取样量为两副：批量在30副～100副之间时，取样量为3副；批量超过100副时，取样量为3%，但最大取样量为10副。
每副手套的外表面用40mL无内毒素水（《中国药典》中规定的细菌内毒素检查用水）在37C～40℃下浸提40 min~～~60 min,浸提过程中要保证手套的整个外表面与浸提介质接触。必要时将浸提液以2 000g离心15min,以除去微粒。离心后取出浸提液立即进行内毒素试验。注，其他现有公认的内毒案分析方法，只要经过确认并与本标准所规定的方法具有相关性，也可用来进行常娩质量控制。
6试验报告
试验报告至少应包括下列信息：本标准编号：
手套类型和生产批号：
制造商或供应商和试验室(如果不同)名称和地址；试验甘期；
所用试验方法的描述；
试验结果。
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A.1范国
附录A
（规范性附录）
用改良LOwry分析法测定天然橡胶手套水溶性蛋白质的方法本法用于天然橡胶制成的医用手套内水溶性蛋自质总量的测定，本法已经在实验室间进行的比对试验中得到了确认。本法定量测定蛋白质低限值约为每克手套19ug（即每毫升浸提液2μg蛋白质）。像表面活性剂、促进剂和抗氧化剂等在手套生产过程中添加到天然像胶中的化学物质会对显色过低显色，而有些物质可能会增强显色。如果在试验中因干扰导致出现程有干扰作用，有些物质可能会降。误差，则可以采用任何经确认过的基酸分析方法（如附录C给出的方法）。注，使用该方法的人员应熟验室一般规程。该方法设有涉及安全问题，如使用方法步及该类问题，使用者有责任建立相应的安全与卫生规程，并确保与国家规定的要求精，致A.2原理
水溶性蛋白质被
后加入脱氧服酸钠，用酸使其沉淀、浓缩并将其从水溶一种缓冲溶液中器
性物质（可能对测定有
优）中分离
沉淀出的蛋白质重新潜解于碱中，并用改良Lowry法比色定量。D质与铜和alin试别在碱性介质中及应呈现蓝色的特正，用分光光度计在分析的原理是基于
600nm~750nm
A.3试剂
A.3.1总则
范围内测量。
二次蒙水或相同质量的水，所有试剂应为分析纯试验用水应为
A.3.2浸提介质
A.3.2.1 N-三(羟
注英文名称为N-t
甲基2-氨基乙烷磺酸（Tl），半钠盐（hemisodiumsalt）droxymethayl -methyl2
A.3.2.2浸提缓冲液用水容解24
持在7.4士0.2的等效的受的实统都可以使用。Sfonsactd(TES).
taanes
稀释全
注：制备足量的手套浸提液（）蛋白质标准液（A.6.3.2）和空白液。任何能使手套浸提液的PH值保
A.3.2.3染色液，溴酚蓝的钠盐容液，用水溶解100mg溴酚蓝并稀释至1.保存4周。A.3.3Lowry蛋白质分析试剂盒
注：该试剂盒可以采用现用的化学品制备时，也可以购买成套试剂。本标准的方法是用或套试剂进行确认。A.3.3.1试剂A，铜试剂（碱性酒石酸铜或柠檬酸铜溶液）A3.3.2试剂B,稀释的Folin试剂。A.3.4氢氧化钠溶液，「c(NaOH)-0.1mol/L]。A.3.5脱氧胆酸钠（DOC)，用水溶解0.15g脱氧胆酸钠并稀释至100mL。溶液制备后保存4周。A.3.6三氯乙酸（TCA）.4.4mmoL/L水溶液，用水溶解72gTCA并稀释成100mL即得。溶液制备后保存4周。
A.3.7磷钨酸（PTA）,用水溶解72gPTA并稀释至100mL。溶液制备后保存1周。1）LowryMicroDC蛋白质成套分析试剂（分炎号为500-0116）可从BioRad实验室购得，地点：2000AlfredNobelDrive，Hercules，CA9456547，USA。这一信息仅为本标准的使用者提供使利，并不意味着CEN对这一产品的认可。
A.3.8卵清蛋白.从炼干的鸡蛋2中提取，无盐。A.4仪器
A.4.1合成手套，尤粉。
A4.2离心机，离心力至少可达到6000g。YY/T 0616—2007
A.4.3离心试管，30mL或50mL聚丙烯试管，试管的蛋白质吸附量每管不超过10μ，不要使用玻璃器具，因其表面吸附蛋白质。
注：第A.5章给出了一种测定蛋白质吸附量的方法。A.4.4滤膜，一次性使用，孔径为0.22um,每个滤膜的蛋白质吸附量不超过10μg。注；第 A.5章给出了一种测定蛋白质吸附量的方法。A.4.5注射器，一次性使用，20mL，用聚乙烯或聚丙烯材料制造。微型试管,2 mL，用聚丙烯材料制造。A,4,6
右英比色池，1 tm。
酶标板，96孔，平底，用聚苯乙烯材料制造，或一次性板池（A.1.9）。一次性板池，1.5ml.半微型，1un，用聚苯乙烯材料制造。酶标仪，波长范围600nm~750nm，分光光度计，波长范围230nm~750ntm。涡旋式混合器。
微量移液器，带有一次性聚丙烯吸头。夹具，用于浸提过程中密封手套防止漏水。推荐使用衬有泡沫橡胶可旋紧的铝质夹具（见图A.t)，或170rrim长的血液透析塑料夹具。5
1-—外手套；
一内手套，
浸提缓冲液；
一染色溶液；
5——手套爽具。
图A.1手套漫提免费标准下载网bzxz
2）该卵清蛋白总用鲜鸡蛋白通过在pH4.5下用硫酸敏分馏和反复结晶制得。如SigtaA553.鸡蛋凹，V级，可从Sigmar Chemical Co. P. O. Box 14506,St Louis ，MO6317只，UJSA 购得。这一信息仅为本标准的使用者提供便利,并不意味着 CEN对这-产品的认可。5
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A. 4. 15振药器。
A.5蛋白质吸谢量测定
A.5.1 总则
椎荐使用一次性聚两烯器（骤丙烯被认为具有低蛋白质结合力）：在使用一批新的离心试管或过滤装置以前，应使用下列方法检查其蛋白质结合力。试验应在1d之内进行。A,5.2商心试管的蛋白质啵附量
A.5.2.1.在离心试管(A,4.3)中加 30 ml.含 10 μg/mL卵清蛋白的标准溶液,标推溶的配制方法是用浸提缓种液（A.3.2.2)稀释蛋白质备（A.6.3.1)，A,5,2.2移取 10 L卵清蛋白溶液(A.5,2.1)至新的离心试管中,在振满器(A.4.15)上振药。确保试管所有表面被溶液浸润，30min后再将此管溶液移至另外个试管中振荡。以此步骤浸润5支试管后收集剩余试验液。同法操作乎行管。A.5.2.3用A.6.4~A.6.6所给方法分别测定标准游获和两份试验液中蛋白质浓度，各词量三次。A.5.2.4按式（A1算每管卵清蛋口平均吸附量：0= 10(R·T)/5
= 2(R— T)
武中：
0—吸附的卵清蛋白量，单位为微克（ug）;R—标准溶液卵清蛋含量三饮測量的平均值；T一试验液卵清蛋口含量的均值（即六个测最值的平均值）。每管吸附的卵清蛋百量(O)应小于10 μg。否则，这些试管不适合用于御量。A. 5.3过题装置的蛋白吸附盘测定....( A.1)
A.5.3.1在离心试管(A.4.3)中加30ml.含10 μg/mL.卵清蛋白的标准溶液，标准辫液的配制力法是用浸提缓冲液（A.3.2.2)稀释蛋白质储备液（A.6.3.1)。A.5.3.2准备两叠滤膜（A,4.4)，每叠五张，每叠过滤10mL标准溶液至离心试管中A.4.3）A.5.3.3用A.6.4~A6.6所给方法分别测定标准溶液和两份试验液中蛋白质浓度，各测量三次，A.5.3. 4按式(A,2)计算每管卵清蛋白平均吸附量：O- 10(R- T/5
=2(RT)
武中：
0—吸附的卵清蛋白量，单位为微克（）；尺一一标率液卵清蛋白念量三次测量的平均值T—一试验液卵清蛋白含量的平均值(即六个测最值的平均值)。每滤膜吸附的卵清蛋白最(()应小于10 g。否则,这些滤膜不适合用于测量。A.6步骤
A.6.1总则
++++.--( A,2)
步骤包括了手套浸提、然后以系数5对浸提液浓缩，使其纯化。用同法浓缩的蛋白标准液制作校准曲线，依据校推曲线测定浸提液中蛋白质含量。取两只手套，同时漫提一只的内部和另一只的外部。这可使浸提体积最小至25mL，耳由于浸提缓冲羧只与手套接触，避免了与容器表面接触所引起的白质损失。注：其他爱提步骤只要参比本方法经过确认也可以使用。在欧洲和美国与所选定的一些实验室中所进行的实验室向的比对试验表明按ASTMD5712标准把手套剪成碎片再在pH值为7.4的TES缓冲液中25℃下浸提2h的测定结果与本法相当。
A. 6. 2漫提步骤
A.6.2.1戴合成手套(A，4.1)操作手套样品。YY/T 0616—2007
取8只同规格，同批手套样品，并分成4对。若手套是分左右手的，则择选4只右手样品、4只左手样品，分成两对右手和两对左手。先在每对手套中选一只自中指尖向腕部取 20 cm处做一标记,称量(m1),精确到 0. 1 g。再将另一只手套插人到做了标记的手套内，使其完全物合，如图A，1所示。注：将一只手套插人另只的方法对试验并不十分重要，但其操作要尽可能简化。为此可以先向内手套的拇指和小拇指插入一回棒帮助将其插人外手套的相应的手措内，同样用圆棒将其他三个指插人。A.6.2.2将足量的染色液（A.3.2.3)充满内手套的五个手指内。在内外手套之间注人温度为（25二5)℃的浸提缓冲液（A,3.2.2）。对于规格较大的手套，加入的缓冲液体积可增加至50mL。排出大多数空气泡，并按图A.1所示用夹具（A.4.14)在20m标记处密封，以防止液体漏出。A.6.2.3将手套置于振荡器（A.4.15).上于（25士5)℃下振荡（120士5）min。A.6.2.4取下夹具，仔细分开手套。注意不要使染色液污染浸提液，如果浸提液呈蓝色，应弃之用新手套重新浸提。
A.6.2.5将浸提液移人离心试管（A.4.3)中，不低于2000离心15tmin，或用一次性使用滤膜(A.4.4)过滤，也可两种方法并用，使之證清。制得的清澈液可在2℃~8℃下冷藏并在48 h内测定，也可在一18℃以下冷冻，不超过两个月内测定。A.6.2.6从浸提过的外手套20tI标记以上的腕部切下，用吸水纸换去表面液体，室温下晾干，称量(mz）,精确到0.1g，按式（A.3)计算该手套浸提部分的质量：m= m-m2
A.6.3蛋白质标准液
A,5.3.1蛋白质储备液
++++++++( A.3
将 25 mg卵清蛋户溶解于 25 mL 浸提缓冲液(A, 3. 2. 2),制备标称浓度为 1 mg/mL 卵清蛋白溶液。用0.22m滤膜（A4.4)过滤用0分光光度计在280Ⅱm处用石英池（A,4.7)测定吸光度计算实际卵消蛋白浓度。吸光度除以0.7153即是实际的浓度值(mg/mL)。该落液在冷条件下可稳定2d,在一18℃以下玲冻可稳定两个月。解炼需在45℃下加热15 min。A.6.3,2蛋白质标准液
用浸提缓冲液(A.3.2.2)稀释储备液制成系列标准液。使溶液浓度约为100tg/mL.50g/mL20 μg/tmL、10 μg/ml..5 μg/ml,和2 μg/ml-.用漫提缓冲液作空白。这些溶液在冷藏条件下可稳定2 d,在-18℃以下冷冻可稳定两个月。解冻需在45℃下加热15min。A.6.4蛋白质的沉淀与浓缩
A.6.4. 1在(25±5)℃下做平行试验。A.6.4.2精确移取空白液，蛋自质标准液（A.6.3.2)和三个手套的浸提液A.6.2.5)各1mL至微型试管(A. 4, 6)中，加 0. 1 mL DOC(A, 3. 5)，涡旋混合后放置 10 min，加 0, 1 mL TCA(A,3, 6)和0.1mLPTA(A3.7)，涡旋混合后放置30min。A 6.4. 3在 6 000 g 下离心15 min。倒出上清液,并将各试管倒置于吸水纸上 5 min。A6.4.4向包括空白衣内的各试誉中加0.1mo1/L的氢氧化钠游液（A.3.4)0.2mL。在祸旋混合器上混合使沉淀出的蛋白质溶解。确保使蛋白质完全溶解成清澈液。有些手套有时需在（5士3）℃下过夜冷裁。如果仍有沉淀物，以 0.20 mL为单位，逐步加人标定过的氢氧化钠溶液，最多至总量为1 mL，以后步均用0. 2 1nL 的整数倍。沉淀前稀释这种样品浸提液可能是有效的。3）假定分子最为 43 Q00 Da：280 um 和 pH7.4下 30 745 的摩尔消光(mular extinctoin),1 cm 比色池下 pH7, 4的0, 1 mol/L. TES 缓冲液中 1 mg/ml. 卵清蛋白的消光是 0. 715。7
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注：将蛋白质沉寇后再溶解的的是使蛋白质纯化，排除于扰物。这一过程中难免会有一定草的蛋白质揽失。本试验慢定蛋白质标雅液损失与样品浸提液中损失的白分比相同,但尽管如此,宜使损失为最小,因为过量的摄失是不能补偿的，
A.6.5显色
A.6.5.1本标准所描述的方法是采用市售的用于确认的试剂盒，其他试剂盒或自行制备的试剂可能需要采用不同的体积和培养时间。A,6.5.2向含有再次溶解的蛋白质溶液和空白微型试管中加 0.125 mL试剂 A(A,3.3.1),充分混合。加1mL试剂B(A.3.3.2），加盖。涡旋混合30min，使显色完全。这一阶段会产生沉淀，测量吸光度前离心或滤除沉淀物。
A,6.6. 1酶标仪
移取一定量的溶液(A,6.5.2）至酶标板(A,4.8)的孔中,充满孔,如 500 μ1.孔中注人 490 μI.。在600 nm~750 nm规定波长范围内以空自作参比测量吸光度。，标准获和手套浸提液在显色稳定后 1 h内进行分析,这样做的结果具有一致性。A, 6. 6. 2分光光度计
移取溶液(A.6.5.2)至--次性板池(A,4.9)在 G00 nm-~760 nm规定波长范围内以空白作参比测量吸光度，
注：标准液和手套浸提液在显色稳定后 1 h内进行分折。这样做的结果具有--致性。A.7结果表示
A,7. 1计算
A7.1.1校准曲线法
计算平行测量的平均吸收度。如果个值超出均值的20%，重新测量。绘制平均吸光度对应于原蛋白质标准液的实际浓度校准曲线，如图 A,2所示。在蛋白质标准液含量为0 μg/mL～100μg/mL的范周内校准曲线应为线性
注，在浓缩讨程中据失一部分蛋白质,假定浓缩过程中蛋白质标准辣捐失与样品浸提液中摄失的百分比相同1
浓度em
暖光度
暇光度
计算机生成的最近供的方程式
v=-4F-0. 5r2+0. 013x+D. 024 740
分光光度计用1cm池在750mm下测得的典型标准曲线图A.2
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