【农业行业标准(NY)】 生鲜牛乳中体细胞的测定方法

ICS67.050
中华人民共和国农业行业标准
NY/T800-2004
生鲜牛乳中体细胞测定方法
Enumeration of somatic cells in raw milk(IS0 13366-1:1997, Milk—Enumeration of somatic cells—Part 1:Microscopicmethod, IS0 13366-2: 1997, Milk-—Enumeration of somatic cells--Part 2:Electronic particle counter method, ISO 13366-3: 1997, Milk--Enumeration ofsomatic cells-Part 3:Fluoro—opto-electronic method, MOD)2004-04-16发布
2004-06-01实施
中华人民共和国农业部
本标准修改采用1SO13366一1：1997《牛奶NY/T800—2004
体细胞测定方法
第一部分显微镜法》、ISO
13366—-2：1997《牛奶体细胞测定方法第二部分电子粒子计数法》和ISO13366—3：1997《牛奶体细胞测定方法第三部分荧光光电计数法》。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位：农业部乳品质量监督检验测试中心、农业部食品质量监督检验测试中心（上海）、农业部食品质量监督检验测试中心(佳木斯)和农业部食品质量监督检验测试中心(石河子)。本标准主要起草人：王金华、张宗城、刘宁、孟序、陆静、张春林、王南云、罗小玲、程春芝。I
1范围
生鲜牛乳中体细胞测定方法
本标准规定了生鲜牛乳中体细胞的测定方法。本标准适用于标准样、体细胞仪的校准以及生鲜牛乳中体细胞数的测定2规范性引用文件
NY/T800—2004
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB6682分析实验室用水规格和试验方法3显微镜法
3.1原理
将测试的生鲜牛乳涂抹在载玻片上成样膜，干燥、染色，显微镜下对细胞核可被亚甲基蓝清晰染色的细胞计数。
3.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用化学纯和蒸馏水。3.2.1乙醇,95%。
3.2.2四氯乙烷(CHCl4)或三氯乙烷(CHsCl)。3.2.3亚甲基蓝(Ci6HigCINS·3H2O)。3.2.4冰醋酸(CHsCOOH)。免费标准下载网bzxz
3.2.5硼酸(HsBO)。
3.3仪器
显微镜：放大倍数×500或×1000，带刻度目镜、测微尺和机械台。微量注射器：容量0.01mL。
3.3.3载玻片：具有外槽圈定的范围，可采用血球计数板。3.3.4水浴锅：恒温65℃±5℃。3.3.5
5水浴锅：恒温35℃±5℃。
5电炉：加热温度40℃土10℃。
砂芯漏斗：孔径≤10um。
3干发型吹风机。
3.3.9恒温箱：恒温40℃45℃。
3.4染色溶液制备
在250mL三角瓶中加人54.0mL乙醇（3.2.1)和40.0mL四氯乙烷（3.2.2），摇匀；在65℃水浴锅(3.3.4)中加热3min,取出后加人0.6g亚甲基蓝（3.2.3），仔细混匀；降温后，置入冰箱中冷却至4℃；取出后，加人6.0mL冰醋酸(3.2.4)，混匀后用砂芯漏斗(3.3.7)过滤；装人试剂瓶，常温贮存。3.5试样的制备
NY/T800—2004
3.5.1采集的生鲜牛乳应保存在2℃～6℃条件下。若6h内未测定，应加硼酸(3.2.5)防腐。硼酸在样品中的浓度不大于0.6g/100mL，贮存温度2℃～6℃，贮存时间不超过24hc3.5.2将生鲜牛乳样在35℃水浴锅（3.3.5)中加热5min，摇匀后冷却至室温。3.5.3用乙醇(3.2.1)将载玻片(3.3.3)清洗后，用无尘镜头纸擦干，火焰烤干，冷却。3.5.4用无尘镜头纸擦净微量注射器（3.3.2)针头后抽取0.01mL试样（3.5.2），用无尘镜头纸擦干微量注射器针头外残样。将试样平整地注射在有外围的载玻片（3.3.3)上，立刻置于恒温箱(3.3.9)中，水平放置5min，形成均匀厚度样膜。在电炉(3.3.6)上烤干，将载玻片上干燥样膜浸人染色溶液（3.4)中，计时10min,取出后凉干。若室内湿度大，则可用干发型吹风机(3.3.8)吹干；然后，将染色的样膜浸人水中洗去剩余的染色溶液，干燥后防尘保存。3.6测定
3.6.1将载玻片固定在显微镜（3.3.1)的载物台上，用自然光或为增大透射光强度用电光源、聚光镜头、油浸高倍镜。
3.6.2单向移动机械台对逐个视野中载玻片上染色体细胞计数，明显落在视野内或在视野内显示一半以上形体的体细胞被用于计数，计数的体细胞不得少于400个。3.7结果计算
样品中体细胞数按式(1)计算。
X=100×N×S
式中：
X——样品中体细胞数,单位为个每毫升(个/mL);N显微镜体细胞计数,单位为个；S——样膜复盖面积,单位为平方毫米(mm2)；α——单向移动机械台进行镜下计数的长度，单位为毫米(mm)；d显微镜视野直径，单位为毫米（mm）。3.8允许差
相对相差≤5%。
4电子粒子计数体细胞仪法
（1）
4.1原理
样品中加人甲醛溶液固定体细胞，加入乳化剂电解质混合液，将包含体细胞的脂肪球加热破碎，体细胞经过狭缝，由阻抗增值产生的电压脉冲数记录，读出体细胞数。4.2试剂
所有试剂均为分析纯试剂，实验用水应符合GB6682中一级水的规格或相当纯度的水。4.2.1伊红Y(C2oHgBr4Os）。
4.2.2甲醛溶液,35%~40%
4.2.3乙醇，95%。
4.2.4曲拉通X—100(TritonX-100)(C34H62Ou)。4.2.50.09g/L氯化钠溶液：在1L水中溶人0.09g氯化钠。4.2.6硼酸(HBO3)。
4.3仪器
4.3.1砂芯漏斗，孔径0.5um。
4.3.2电子粒子计数体细胞仪。
4.3.3水浴锅：恒温40℃±1℃。4.4固定液制备
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4.4.1在100mL容量瓶中加人0.02g伊红Y(4.2.1)和9.40mL甲醛（4.2.2）,用水溶解后定容。混匀后，用砂芯漏斗（4.3.1)过滤，滤液装人试剂瓶，常温保存。4.4.2可使用电子粒子计数体细胞仪生产厂提供的固定液。4.5乳化剂电解质混合液制备
4.5.1在1L烧杯中加入125mL乙醇（4.2.3)和20.0mL曲拉通X一100(4.2.4)，仔细混匀；加入885mL氯化钠溶液（4.2.5），混勾后，用砂芯漏斗（4.3.1)过滤：滤液装人试剂瓶，常温保存。4.5.2或使用电子粒子计数体细胞仪专用的乳化剂电解质混合液。4.6试样的制备
4.6.1采集的生鲜牛乳应保存在2℃～6℃条件下。若6h内未测定，应加硼酸（4.2.6)防腐，硼酸在样品中的浓度不大于0.6g/100mL，贮存温度2℃～6℃，贮存时间不超过24h。4.6.2采样后应立即固定体细胞，即在混匀的样品中吸取10mL样品，加人0.2mL固定液（4.4），可在采样前在采样管内预先加入以上比例的固定液（4.4)，但采样管应密封，以防甲醛挥发。4.7测定
将试样（4.6)置于水浴锅（4.3.3)中加热5min，取出后颠倒9次，再水平振摇5次～8次，然后在不低于30℃条件下置入电子粒子计数体细胞仪测定。4.8结果
直接读数，单位为千个每毫升。4.9允许差
相对相差≤15%。
4.10校正
4.10.1在以下情况之一应进行校正：a）连续进行2个月；
b）经长期停用，开始使用时；
体细胞仪维修后开始使用时。
4.10.2校正使用专用标样，连续测定5次，取出平均值。4.10.3标样中体细胞含量为每毫升40万个～50万个，测定平均值与标样指标值的相对误差应为≤10%。
4.11稳定性试验
4.11.1在1个工作日内对体细胞含量为每毫升50万个左右的样品，以每50个样作规律性的间隔计数。
4.11.2在1个工作日结束时，按式(2)计算变异系数。S×100.
CV(%)=
式中：
CV一变异系数，单位为百分率（%）；S一一数次测定的标准差，单位为个每毫升（个/mL)；n一一数次测定的平均值,单位为个每毫升（个/mL)。4.11.3变异系数应≤5%。
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5荧光光电计数体细胞仪法
5.1原理
样品在荧光光电计数体细胞仪中与染色一缓冲溶液混合后，由显微镜感应细胞核内脱氧核糖核酸染色后产生荧光的染色细胞，转化为电脉冲，经放大记录，直接显示读数。5.2试剂
所有试剂均为分析纯试剂，实验用水应符合GB6682中一级水的规格或相当纯度的水。5.2.1溴化乙锭（C21H2oBrN3）。5.2.2柠檬酸三钾（CH,O/K3H2O)。5.2.3柠檬酸（CHOHO)。
5.2.4曲拉通X-100(TritonX-100)(C34H62Ou)。5.2.5氢氧化铵溶液，25%。
5.2.6硼酸(HsBO3)。
5.2.7重铬酸钾(K2Cr20)。
5.2.8叠氮化钠(NaN3）。
5.3仪器
5.3.1荧光光电计数体细胞仪。
5.3.2水浴锅：恒温40℃±1℃。5.4染色一缓冲溶液制备
5.4.1染色一缓冲储备液
在5L试剂瓶中加入1L水，在其中溶入2.5g溴化乙锭（5.2.1），搅拌，可加热到40℃～60℃，加速溶解；使其完全溶解后，加人400g柠檬酸三钾（5.2.2)和14.5g柠檬酸（5.2.3），再加人4L水，搅拌，使其完全溶解；然后，边搅拌边加入50g曲拉通X一100(5.2.4)，混勾，贮存在避光、密封和阴凉的环境中，90 d内有效。
5.4.2染色一缓冲工作液
将1份体积染色一缓冲储备液(5.4.1)与9份体积水混合，7d内有效。5.4.3或使用荧光光电计数体细胞仪专用的染色一缓冲工作液。5.5清洗液制备
5.5.1将10g曲拉通X100(5.2.4)和25mL氢氧化铵溶液（5.2.5)溶人10L水，仔细搅拌，完全溶解后贮存在密封、阴凉的环境中，25d内有效。5.5.2或使用荧光光电计数体细胞仪专用清洗液。5.6试样的防腐
5.6.1采样管内生鲜牛乳中加入荧光光电计数体细胞仪专用防腐剂，溶解后充分摇匀。5.6.2如无以上防腐剂，则在生鲜牛乳采样后加入以下1种防腐剂(24h内）：a）硼酸（5.2.6)：在样品中浓度不超过0.6g/100mL，在6℃~12℃条件下可保存24h；b）重铬酸钾（5.2.7)：在样品中浓度不超过0.2g/100mL，在6℃~12℃条件下可保存72h。5.7测定
将试样(5.6)置于水浴锅（5.3.2)中加热5min，取出后颠倒9次，再水平振摇5次～8次，然后在不低于30℃条件下置入仪器测定。5.8结果
直接读数，单位为于个每毫升。5.9允许差
相对相差≤15%。
5.10校正
5.10.1在以下情况之一应进行校正：连续进行2个月；
经长期停用，开始使用时；
体细胞仪维修后开始使用时。
校正使用专用标样，连续测定5次，得出平均值。NY/T800-2004
标样中体细胞含量为每毫升40万个～50万个，测定平均值与标样指标值的相对误差应≤10%。
5.11稳定性试验
5.11.1在1个工作日内对体细胞含量为每毫升50万个左右的样品，以每50个样作规律性的间隔计数。
2在1个工作日结束时，按式(3)计算变异系数。5.11.2
S×100
CV(%)=-
式中：
-变异系数，单位为百分率（%）；S一一数次测定的标准差，单位为个每毫升（个/mL)；n一数次测定的平均值，单位为个每毫升（个/mL）。5.11.3变异系数应≤5%。
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中华人民共和国
农业行业标准
生鲜牛乳中体细胞测定方法
NY/T800--2004
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