【地方标准】 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法

DB51/T2685—2020
猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法
2020-07-14发布
四川省市场监督管理局
2020-08-01实施

前言
本规范依据GB/T1.1—2009的规定起草。
本标准由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本标准由四川省市场监督管理局批准。
本标准起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川纳比生物科技有限公司。
本标准主要起草人：陈斌、周明忠、陈弟诗、袁旦一、李晓琪、裴超信、张毅、邓飞、李丽、邵靓、陈冬、蔡冬冬、丁梦蝶、邱明双、周莉媛、张睿、辜良斌。

1 范围
本标准规定了猪伪狂犬病毒的交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法。本标准适用于四川省行政区域范围内猪伪狂犬病毒核酸检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T25172—2010 猪常温精液生产与保存技术规范
SN/T3567.1-2013 交叉引物恒温扩增检测方法第1部分：通用技术规程

3 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
3.1 CPA 交叉引物恒温扩增（Crossing Priming Amplification）
3.2 DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
3.3 Bst酶 Bst DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）
3.4 TE缓冲液 Tris-EDTA 缓冲液（Tris-EDTA buffer）
3.5 PRV 伪狂犬病毒（pseudorabies virus）
3.6 PBS 磷酸盐缓冲液

4 仪器
4.1 恒温金属浴。
4.2 高速台式冷冻离心机。
4.3 组织研磨仪或研钵。
4.4 普通冰箱：2℃~8℃。
4.5 普通冰柜：-20℃以下。
4.6 超低温冰箱：可控温至-70℃。
4.7 微量移液器：0.2μL～2.5μL、2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL，并配备与移液器匹配的吸头。
4.8 高压灭菌锅。
4.9 干烤灭菌器。
4.10 普通PCR仪。

5 耗材
5.1 1.5mL离心管。
5.2 0.2mL PCR薄壁管或八连管。
5.3 PCR管漂浮板。

6 试剂
6.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。
6.2 DNAzol：2℃-8℃保存；商品化DNA提取试剂按说明书要求条件保存。
6.3 无水乙醇：-20℃预冷。
6.4 75%乙醇：由无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。
6.5 8mmol/L NaOH溶液：配制见附录A。
6.6 PBS缓冲液：配制见附录A。
6.7 Bst酶及Bst酶反应缓冲液：Bst酶浓度为8U/μL，Bst酶反应缓冲液为10xThermopol*Buffer，Mg2+浓度为100mmol/L。
6.8 dNTPMix：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存，避免反复冻融。
6.9 引物序列参见附录B。
6.10 伪狂犬病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒，-20℃保存备用；阴性对照可采用ddH2O。
6.11 石蜡油：按说明书要求条件保存。

7 样品采集和处理
7.1 采样工具
7.1.1 手术刀、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h或高压灭菌烘干。
7.1.2 一次性无菌棉拭子。
7.1.3 组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2h或高压灭菌烘干。
7.1.4 一次性注射器/真空采血管。
7.2 样品采集