【地方标准】 鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程

ICS 65.020.99 B22 备案号：40456-2014 DB32/T 2570-2013 鸡传染性法氏囊 RT-LAMP 诊断技术规程 Technical code of detecting RT-LAMP for Infectious Bursal Disease 2013-12-20 发布 2014-01-20 实施 江苏省质量技术监督局 发布 前言 本标准为规范鸡传染性法氏囊 RT-LAMP 诊断技术规程，提高鸡传染性法氏囊病毒检测的灵敏度、稳定性和特异性而制定。按 GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》要求编写，附录为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出并起草，起草人包括刘宇卓、李银、黄欣梅、赵冬敏、韩凯凯、张敬峰。 1 范围 本标准规范了鸡传染性法氏囊 RT-LAMP 诊断技术规程所用引物、涉及的样品范围、操作流程和反应条件等技术标准。适用于鸡传染性法氏囊病毒病的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查及分离毒株的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB 16548-2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法 DB13/T 500 商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程 3 主要试剂和仪器 DNAMarker DL-2000 6x Loading buffer Bst DNA Polymerase MgSO4 DEPC 水 Betaine 10X ThermoPol buffer 异丙醇 无水乙醇 琼脂糖 核酸染料 氯仿 电泳仪 电热恒温水槽 引物 引物设计基于 GenBank 上鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）A 节段序列（GenBank AY444873），在 VP3 基因保守区域利用 LAMP primer designing software PrimerExplorer 设计，序列如下： F3: 5'-CCAACTGGGCGACGTTTA-3' B3: 5'-CAGAATGGAACAGTGGGTCC-3' FIP: 5'-GTCCTGCATTGGGTGGAAGGTATTTTTTTTCCTCACAATCCACGCG-3' BIP: 5'-CTGGCTATGGCCGCTTCAGATTTTTGCTGCTTCCATGGCTCT-3' 4 临床诊断 按 DB13/T 500 商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程中 4.1 流行特点、4.2 临床症状、4.3.1 剖检病变进行。 5 采样和样品处理 5.1 病料采集及处理 按照 NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸡无菌采集法氏囊及肾脏、肝脏组织，于 0～4℃ 冷藏保存并立即送检，采样过程中不得交叉污染。 5.2 样品处理 剖检取法氏囊及肾脏、肝脏组织，可单独使用或混合后使用。将病料或经鸡胚接种后的绒毛尿囊膜及胚体置无菌研钵中剪碎研磨，-20℃ 反复冻融三次，将研磨组织以 4℃ 12000 rpm 离心 10 min，取上清备用。 6 RT-LAMP 6.1 RNA 提取 取已处理的待检样品，以已知 IBDV 病毒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，每管加入 Trizol 600 μL，振荡混匀后室温放置 10 min，加入氯仿 200 μL，剧烈振荡后室温放置 1 min，4℃ 12000 rpm 离心 15 min，取上层水相 750 μL，加入 500 μL 异丙醇混匀，-20℃ 放置 15 min，4℃ 10000 rpm 离心 10 min，去上清，缓缓加入 1 mL 75% 乙醇洗涤，4℃ 8000 rpm 离心 5 min，去上清，室温干燥 20 min，加入 DEPC 水 10 μL 溶解。亦可使用 RNA 提取试剂盒。 6.2 反应条件 FIP 引物 1.2 μL，BIP 引物 1.2 μL，F3 引物 0.15 μL，B3 引物 0.15 μL，Bst DNA Polymerase 2 μL，10X ThermoPol buffer 2.5 μL，100 mmol/L MgSO4 1.5 μL，8 mmol/L Betaine 5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，RNA 酶抑制剂 0.5 μL，RNA 模板 2 μL，反转录酶 1.0 μL，ddH2O 4.8 μL，总体积 25 μL，瞬间离心混匀，60℃ 水浴 60 min。