【地方标准】 鹅坦布苏病毒的检测 RT-PCR方法

ICS 65.020.99 B22 备案号：40447-2014 DB32/T 2561-2013 鹅坦布苏病毒的检测 RT-PCR 方法 Method of RT-PCR detecting Goose Tembusu Virus 2013-12-20 发布 2014-01-20 实施 江苏省质量技术监督局 发布 前言 本标准为规范鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术，提高检测的灵敏度、稳定性和特异性而制定。按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写，附录 A 和附录 B 为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出并起草，起草人包括黄欣梅、李银、刘宇卓、赵冬敏、韩凯凯。 1 范围 本标准规范了鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术 RT-PCR 所用引物序列、涉及的样品范围、操作流程和反应条件等技术标准。适用于检测鹅脾脏和病毒细胞培养液中鹅坦布苏病毒核酸。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用必不可少。注日期的引用文件，仅所注日期版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修订单）适用于本文件。 GB 16548—2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法 3 方法原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种分子生物学技术，用于放大特定 DNA 片段，可视作体外的 DNA 复制。PCR 技术以快速、敏感和特异性优点在动物疫病检测中广泛应用。标准选取鹅坦布苏病毒非结构蛋白 NS5 基因保守区域设计特异性引物，并经过 PCR 条件优化、特异性试验和敏感性试验，对鹅坦布苏病毒的鉴定具有高准确性。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 PCR 仪、离心机、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统 4.2 主要试剂 TRIZOL、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC 处理的灭菌双蒸水、AMV 反转录酶、5X AMV Buffer、10 mmol/L dNTPs、随机引物、RNA 酶抑制剂、25 mmol/L MgCl2、10X EXTaq DNA 聚合酶 Buffer、EXTaq DNA 聚合酶、2.5 mmol/L dNTP、DNAMarker DL-2000、琼脂糖、引物 引物序列 上游 F: 5'-GCGGCTCAAGTGGGA-3' 下游 R: 5'-CCTCGGTTGTTTGTTTCT-3' 5 样品采集 按照 NY/T 541-2002 采样方法，病死或扑杀发病鹅无菌采集脾脏、肝脏、脑、肺、肾组织，置于 -20℃ 保存，脾脏为首选样品。采样过程中按 GB 16548-2006 进行无害化处理。 6 方法步骤 6.1 样品处理 取病料 0.5–1 g，按 1:10 加入 DEPC 水，置研钵剪碎研磨，反复冻融 3 次。研磨组织以 4℃ 12000 r/min 离心 10 min，取上清 200 μL 备用。阴性对照为健康鹅脾脏，阳性对照为鹅坦布苏病毒细胞培养物（附录 A）。 6.2 GTMUV RNA 提取 取已处理样品，以病毒细胞培养物为阳性对照，正常脾脏为阴性对照，无菌水为空白对照。每管加入 Trizol 600 μL，振荡混匀室温放置 10 min，加入氯仿 200 μL，剧烈振荡室温放置 1 min，4℃ 12000 r/min 离心 15 min，取上层水相 750 μL，加入 500 μL 异丙醇混匀，-20℃ 放置 15 min，4℃ 12000 r/min 离心 10 min，去上清，加入 1 mL 75% 乙醇洗涤，4℃ 8000 r/min 离心 5 min，去上清，室温干燥 20 min，加入 DEPC 水 10 μL 溶解。 6.3 RT-PCR 6.3.1 反转录反应 反应体系：5X AMV Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，随机引物 1 μL，RNA 酶抑制剂 0.5 μL，RNA 模板 10 μL，AMV 反转录酶 1 μL，DEPC 处理 H2O 1.5 μL，总体积 20 μL，瞬间离心混匀。65℃ 反应 15 min，42℃ 孵育 1 h，95℃ 5 min，同时设立阴性、阳性对照，产物 -20℃ 保存。 6.3.2 PCR 反应 按 25 μL 体系进行，含 25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，灭菌水 15.75 μL，反转录产物 2.5 μL，10X EXTaq DNA 聚合酶 Buffer 2.5 μL，EXTaq DNA 聚合酶 0.2–0.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物各 0.2–1 μL，按常规 PCR 循环条件扩增。