【地方标准】 牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术

ICS 11.220
B 41
DB 37
山东省地方标准
DB37/T 3571—2019

牛副结核病干扰素ELISA诊断技术

Diagnosis on bovine paratuberculosis by enzyme-linked immunoassay of gamma-interferon

2019-05-29 发布 2019-06-29 实施
山东省市场监督管理局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。
本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心。
本标准主要起草人：解晓莉、杨宏军、张亮、孙阳阳、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。

1 范围
本标准规定了牛副结核病干扰素ELISA诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、检测方法、结果判定和操作注意事项等。
本标准所规定的技术适用于牛感染副结核分枝杆菌时干扰素的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求
GB/T 19495.2—2004 转基因产品检测实验室技术要求
SN/T 1084—2010 牛副结核病检疫技术规范

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。

3.1 牛副结核病 Paratuberculosis
一种由副结核分枝杆菌（禽分枝杆菌副结核亚种）引起的以慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的慢性传染病，具有强烈的传染性，可垂直传播。

4 试验原理
被副结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞再次受到相关抗原刺激后，可在短时间内释放大量的干扰素（γ-Interferon），通过干扰素的检测可实现对副结核分枝杆菌感染的诊断。

5 试剂及仪器

5.1 材料
5.1.1 血液处理所需材料
血液培养所需材料参见附录A。

5.1.2 ELISA试验所需试剂
ELISA试验所需试剂参见附录B。

5.2 仪器
检测所需仪器参见附录C。

6 检测方法

6.1 试剂配制
检测所需试剂及制备方法按附录D的规定执行。

6.2 采血
血液的采集按SN/T 1084—2010规定的方法执行。将采集的血液（至少5 mL）放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒6～10次混合血液，使肝素溶解，室温（22℃±5℃）下运送到实验室，并在采血后30 h内进行培养。

6.3 全血培养

6.3.1 血液分装
用一次性自动移液器在无菌条件下将抗凝血加入24孔组织培养板，每份血分三孔，1.5 mL/孔。

6.3.2 加入抗原
6.3.2.1 无菌操作下分别加入100 μL PBS（阴性抗原对照）、禽结核提纯菌素（A-PPD）及牛结核提纯菌素（B-PPD）至相应的孔。
6.3.2.2 用微量振荡器高速振荡1 min，将抗原与分装的血液充分混匀。或将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10次。

6.3.3 孵育
将组织培养板在37℃恒温培养箱中孵育16 h～24 h。

6.3.4 血浆样品收取及贮存
用可调移液器小心吸取约400 μL的上层血浆，转入新的1.5 mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。将盖子密封，标明时间、编号等信息，在2℃～8℃可贮存7天，在-20℃可贮存数月。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。

6.4 检测步骤
6.4.1 溶解冻干试剂，按说明书要求平衡其他试剂。
6.4.2 按照商品化牛IFN-γ检测试剂盒说明书进行牛IFN-γ的ELISA检测。
6.4.3 质量控制。按照试剂盒质量控制标准判断试验的有效性。如果试验中阴阳性对照结果有一条不符合试验标准，试验则视为无效，应重新检测。

7 结果判定

7.1 样品结果计算
计算每个样品阴性抗原、A-PPD和B-PPD的平均OD值。