【地方标准】 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程

ICS 65.020.01
B 40
DB 37
山东省地方标准
DB37/T 3572—2019

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程
Code of practice for detection of A2 type of β-casein (A2 milk) in cow's milk

2019-05-29发布
2019-06-29实施
山东省市场监督管理局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。
本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省畜牧总站、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业科学院畜牧研究所。
本标准主要起草人：黄金明、王秀革、瀚志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、魏晓超、高亚平、刘文浩、高运东、侯明海、杨国瑞、戴蕴平、仲峰。

1 范围
本标准规定了牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测方法。
本标准适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
GB/T 19495.2—2004 转基因产品检测实验室技术要求
GB/Z 35959—2018 液相色谱-质谱联用分析方法通则

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
A2型β-酪蛋白 A2 β-casein
A2 β-酪蛋白由224个氨基酸（含有15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I），当第51位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分别为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为A2型β-酪蛋白。
3.2
A2奶 A2 milk
所含β-酪蛋白为A2型的牛奶称为A2奶。
3.3
质谱法 mass spectrometry; MS
试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。
3.4
质荷比 mass-to-charge ratio
离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。

4 检测原理
β-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（p.51E>K、p.52E>K、p.82P>H、p.103L>I、p.108M>L、p.121H>Q、p.137S>R、p.167P>L）（参考序列：GenBank AAA30431.1），而不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同变体型β-酪蛋白检测的目的。

5 主要试剂配制
实验所用水为符合GB/T 6682规定的双蒸水。
高压灭菌条件为121℃，1.034×10^5 Pa压力，蒸汽灭菌20min。
试剂配制见附录A。

6 主要仪器设备
见附录B。

7 质谱检测及数据处理参数
见附录C。

8 检测方法
8.1 样本采集
8.1.1 待检测的新鲜牛奶
每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50mL，充分混匀后，-80℃保存。
8.1.2 待检测的商品化奶粉
包装未开封，常温储存。

8.2 蛋白提取
8.2.1 从-80℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50μL；或称取奶粉样本30mg。
8.2.2 向上述样品中加入500μL裂解液【8M尿素，30mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】，冰上裂解10min。离心，4℃，20000g，30min。取上清，避免吸到油脂。
8.2.3 加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10mM，56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至终浓度55mM，暗室静置1h。
8.2.4 使用考马斯蓝染色法（Bradford法）对蛋白质进行定量。
8.2.5 对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定（如附录C.1）。

8.3 蛋白质的消化
8.3.1 每个样品取20μg蛋白，加入到10K超滤管中，14000g，4℃，离心40min，弃废液。
8.3.2 加入200μL的25mM碳酸氢铵（NH4HCO3），14000g，4℃，离心40min，弃废液。
8.3.3 重复上述步骤两遍。
8.3.4 加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。离心收集消化后的肽段。