【国家标准(GB)】 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 20191--2006
饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验Microhiological examination of Lactobacillus acidlophilus in feeds2006-05-17发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2006-09-01实施
GB/T 20191—2006
本方法主要参考GB/T16347一1996%乳酸菌饮料日乳酸菌的微生物学检验》，结合我国饲料中允许使用的乳菌的种类，以及参考乳酸菌的分类鉴定过程制定的。本标准的附录A为规范性附录。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口，本标准起草单位：国家饲料质量髋督检验中心（北京）。本标准主要起草人：饶正华、李丽蓓、杨曙明、苏晓鸥1范
饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验本标雅规定了饲料中嗜酗乳杆菌数的测定及鉴定方法。GB/T 20191--2006
本标推适用丁含有有益微生物嗜髋乳杆菌的各种饲料中嗜酸乳杆荫数量的测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡尼注日期的引用文件其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引文件，其最新版本适用于本标谁。GB/T14699.1何料采样
3设备和材料
3.1恒温培养箱36%℃±1%
3.2 冰箱:0℃~4,
3.3恒温水浴：46℃士1℃。
3.4电,可调式：
3.5吸管：容为1ml10 ml25ml.
3.6广瓶或三角瓶：容量为500 mJ.。3.7平：直径为9cm，
3.8试管,18 mm×180 nm,
显微镜：400培
高压灭菌锅：使用温度为121℃。3.10
烘箱：使用温度为160元
4培养基和试剂
除非另有说明在分析中仅使用确认为分析纯的试剂、蒸馏水或去离子水或相当纯度的水，4.1改良 MC培养基(madifiel chbalrners培养基)见第 A. 1章）。4.2氯化钠。
4. 3苹兰氏染色液（见第 A,6 章）。4.43%过氧化氢落液。
4.5髋基质试剂(见第 A. 1 章）4.6硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。4.7
明胶培养基（见第A.5章）
4. B乳酸杆菌糖发醇管(见第 A,2 章),4.9七叶培养基(见第A,3章），
5采样与试样制备
5、1采样工具·如探子、铲子、匙,采样器、诚皙、「瓶、剪了等,应是灭菌的，5.2样品包装为装、瓶或罐装若，取完整末开封的。样品固体粉末，应边取边混：样品是流体，遍过1
GB/T 20191-—2006
振播即可混匀。样品送到微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h。如果路途遥远，可将试样于0℃~5℃中保存（如冰壶）
5.3采样数最和方式按GB/T14699.1执行。6嗜酸乳杆菌数的测定
6. 1检验程序
嗜酸乳杆菌数检验程序如图］
配成儿个适当舒教前释液
选择2个--3个适当释使，各以【m1最加入炎菌平血内+.
每血内加入适流改良MC培养基
72h±1h
菌落计激、定
图 1 嗜酸乳杆菌数检验程序
6. 2 操作步骤
6.2. 1以无菌操作将经过充摇的试料25 g惑25L1放人含猎225 mL炎菌4现盐水（见第 A，7章的菌！口瓶内配1：10的均氢稀释淤6.2.2用1 ml.灭菌吸管吸取 1：I0 稀释液1 mL,消管壁徐徐注人含有 9 ml.灭菌生理盐水（见第A,7竞)的试管内(注意吸臂尖端不要触及管内稀释液）。6.2.3另取1 mI.灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍逆增稀释液，如此每递增－次，即换用1支1 ml.灭吸管。
6.2.4选择2个-3个以上宜稀释度,分别在作10倍逆增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1 ml.稀释被下灭菌半血(3.7)内,每个稀释度作两个平血。6.2.5薪释液移人平后i,应即时将冷至50℃的改良 MC培养基(4. 1)注人半Ⅲ约 15 mL，并转动平Ⅲ使混合均勾，同时将计数培养基倾人加有1 mI.稀释液试料用的灭菌生理盐水的火菌平叫内作空白对照，以上整个操作白培养物蜘人培养Ⅲ开始至接种结束须在 20 tnin内完成6.2.6待培养基凝问后，翻转平板，置36℃+1℃慎温培养箱（3.1)内培养72h上1h取出，观察菌落特征，选取菌落数在30~~300之间的乎板进行数。6.3菌落特征
嗜酸乳杆荫在改良MC培养基（4.1)上菌落生长形态特征觅表］。2
菌种类型
嗜酸乳杆菌的鉴定
表1酸乳杆菌在改良MC培养基上的菌落特征菌落特征
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平血底为粉红色，菌落较小，圆形，红色边缘似星状.直径2mm大1mru，有演演的掌7.1菌种制备：白平板上挑取单菌落，接种丁改良M:培养基（4.1)斜面，于36℃七1℃24h～48h培养，刮取菌芒分别进行下列赋验。了2进行革兰既染负，显微镜（3，9检查，并做讨氧化氯酶试验。嗜酸乳杆菌应为革兰民阳性，无饱过氧化氢酶阴性的杆菌。进一步鉴定需做硝盐还原,明胶凝化、产靛基质、产硫化氢和碳水化合物发酵试验。嘴酸乳杆菌被少见还原硝酸盐：不液化明胶，不产生旋堪质和硫化氢。7. 3嗜酸乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果及其与干酪乳杆菌和植物乳杆菌的区别,见表2，表 2 饲料中常用乳杆菌的碳水化台物发酵试验结果苗种名淼
嗜酸乳杆菌
干乳杆荫
殖物乳打菌
阳性；
阴性：
七叶仔
」纤维二糖
有些菌抹性：有世菌株阴性
麦萃糖
H磷醇
水杨苷
棉籽糖
山梨醇
注2；本表中列出干酯乳杆菌与殖物乳杆菌的碳水化合物发醇是为与饲料中允许使用的其他乳杆菌相区别。嗜酸乳杆菌与二者水化合物发酵试验的主要区别在于甘露醇和山裂醇试验。8结果计算及表述
菌落计数后·随机挑取5个菌落进行鉴定（见第7章），根锯证实为嗒腰乳杆菌菌落数计算出该血内的此蘭数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此菌数、按式（[)计算：xT
（1）
A--測定的嗜酸乳杆菌菌落数,单位为菌落形做单位每克(efu/g)或菌落形成单位每毫升(clu/ml.1B·嗜酸乳杜菌的可疑菌落总数
C一—-5个鉴定的菌落中确认为嗜酸乳杆菌的菌落数f一稀释倍数。
例如含有嗜酸乳杆菌的试料中10“稀释液在改良MC培养基平板上，生成的嗜酸乳杆菌可点菌落为1010个,取5个鉴定,证实为嗜酸乳杆菌的是4个，由1试料中含嗜酸乳杆菌菌数为：100×105-8.9x 10°。
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A. 1改良 MC 培养基
A,1. 1 成分
大豆蛋白陈
酵母浸膏
水加至1000 ml
硫酸粘杆菌素 R(酌情灿)
A. 1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基及染色液
牛肉浸膏
葡萄糖
碳酸饼
1%中性红溶液
10万国际单位
将除了中性红溶液和硫酸粘杆菌素B以外的其他7种成分加人蒸馏水中，如热溶解，校正pH6,0，加人中性红率液。分装烧瓶,高压灭菌 121℃15 min-~20 min。临用时热熔化培养基,冷至 50℃,酌情加或不加硫酸粘杆菌索B(样品中怀疑有杂菌污染时,可加硫酸粘杆菌素B,混勾后使用)A.2乳酸杆菌糖发酵管
A.2.1基础成分
牛肉膏
醇母浸膏
蒸馏水
A.2.2制法
1 000 mL
按0.5%加人所需糖类，并分装小试管。A.3七叶苷培养基
蛋白豚
七叶昔
1.6%浪甲酚紫酒精溶液
A. 4靛基质反应培养基及试剂
A.4.1蛋白陈水
A.4.1.1成分
胰蛋门
IDOL-色氨酸
A.4.1.2制法
蛋白陈
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
磷酸氢二钾
柠檬酸铁
蒸馏水
氨化钠
蒸馅水
1000 mL
将上述各成分溶解于 100r℃水中,过滤,校正 pH7. 5,分装于小试管中,每支 5 mL,121℃高压灭菌15tnin
A.4.2柯凡克试剂
A,4.2. 1 成分
对二甲氮基苯甲
A. 4. 2.2 制法
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后缓缓加人浓盐酸。A. 5明胶培养基
A,5.1基础成分(pH7.0)
亞白藤
葡萄糖
蒸馏水
A.5.2盐溶液成分
无水 CaCl
K,HFO,
100 mL
酵呼提取物
盐溶液
MgS0, - 7H,0
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将 CaCl.与MgS0,·7H,U混合溶解于 300 mL燕馏水中,再加 500 mI.水，-边搅拌-边缓慢加人其地盐类，继续搅拌真到全部溶解，加200mL蒸馏水，混合后4℃储凝备用。A.5.3制法
将拟分装的试管内加人明胶(0.6 g/管),再将上述配制煮沸后的培养基分装其中（5 HiL/替)113℃-~115C高压次满15 min~20 min：A.6革兰氏染色液
A.6.1草酸铵结晶紫染液
A液：结晶紫2g，95%乙醇20 riL。[3 液:草酸铵 0,8 g+蒸馏水 80 mL.混合 A 液和 B液,静置 48 h 后使用。A, 6. 2番红染色液
番红2.5，95%乙醇100nL
取上述配好的番红酒精落液10mL与80ml.蒸馏水混句即可A,6.3碘液
碘片 1 B;碘化钾 2 g 蒸馏水 300 ml.。先将碘化钾落解在少量水中，再将碘片落解在碘化钾溶液中，待碘完全溶解后加足水分即可。A.7生理盐水
将蒸馏水加人8.5的氯化钠中做成1000mL的落液。在 121℃ F炎菌 15 min。
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开本6801230[/16
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2006个8月第－版
2:06 年: 8 月第一次印刷
3定价10.00元
号：1550661-27873
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