【地方标准】 马链球菌兽疫亚种的检测 PCR方法

ICS 65.020.30 B41 江苏省地方标准 DB32/T1769-2011 马链球菌兽疫亚种的检测 PCR方法 Method of PCR for Detecting Streptococcus zooepidemicus 发布日期：2011-05-06 实施日期：2011-07-06 发布单位：江苏省质量技术监督局 前言 为规范马链球菌兽疫亚种分子生物学检测技术，提高检测的灵敏度、稳定性和特异性，制定本标准。本标准按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》编写，附录A为规范性附录。 本标准由江苏省农业科学院提出并起草。 主要起草人：倪艳秀、何孔旺、吕立新、张雪寒、周俊明、俞正玉、茅爱华、温立斌、郭容利、李成仁、李彬、王小敏。 1 范围 本标准规定了马链球菌兽疫亚种PCR检测方法所需的仪器设备、主要试剂、引物、操作步骤、结果判定、废弃物处理及防污染措施等技术要求。本标准适用于马链球菌兽疫亚种的PCR检测。 2 规范性引用文件 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 PCR（聚合酶链式反应）是在DNA聚合酶催化下，以模板DNA为基础，通过变性、退火和延伸等步骤进行体外扩增DNA的技术。本方法依据GenBank公布的马链球菌兽疫亚种M蛋白基因序列，在其保守区域设计特异性引物，通过优化PCR反应条件，实现对目标DNA的快速、特异性扩增，从而对该病原进行准确检测。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 包括高速离心机、水浴锅、PCR仪、核酸电泳仪及凝胶成像系统。 4.2 主要试剂 除另有规定外，均为分析纯试剂，包括生理盐水、蛋白酶K、Taq酶、dNTP、琼脂糖（电泳级）等。 5 引物 上游引物：5′-GCAGCCCTCTTGGTTGGT-3′； 下游引物：5′-CTGCGTCAGCGTCTCCAT-3′。 6 方法步骤 试验用水应符合GB/T 6682-2008三级水标准。 6.1 样品处理 6.1.1 病料样品处理 采用差速离心法：取约5 g病料，剪碎研磨后用5 mL生理盐水混悬，先以2000 r/min离心2 min去除大颗粒组织，再取上清以10000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用灭菌水重悬备用。 6.1.2 可疑培养物处理 取1 mL培养物，以10000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用200 μL灭菌水重悬备用。 阴性对照为液体培养基，阳性对照为马链球菌兽疫亚种培养物，均按相同方法处理。 6.2 DNA提取 取样品溶液200 μL，加入蛋白酶K（20 mg/mL）3 μL，在42℃作用1 h后煮沸5 min，再以10000 r/min离心5 min，取上清作为PCR模板。 6.3 PCR扩增 6.3.1 反应体系 总体系25 μL，包括：10×buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mM）1.5 μL，dNTP（2.5 mM）1.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板DNA 3.0 μL，Taq酶0.5 μL，其余为灭菌水补足。 反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，60.2℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。 6.3.2 电泳 PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压120 V，时间约30 min。 6.3.3 结果观察 使用凝胶成像系统观察并记录结果。 7 结果判定 7.1 试验有效性 阳性对照应在364 bp位置出现特异性条带，阴性对照无条带，方可判定试验有效。 7.2 判定原则 在试验有效的前提下，若样品在364 bp位置出现特异性条带，则判定为阳性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阳性。