【国家标准(GB)】 牛海绵状脑病诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T19180--2003
牛海绵状脑病诊断技术
Diagnostic techniques for bovine spongiform encephalopathy2003-06-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-12-01实施
GB/T19180—2003
牛海绵状脑病是动物传染性海绵状脑病的一种，对动物和人有着持久性危害并最终致死，世界动物卫生组织(OIE)将之列为B类动物疫病,我国将其定为一类动物疫病。本标准是依照OIE的《诊断试验和疫苗标准手册》（2000年版）（《Manual of Standards forDiag-nositic Tests and Vaccines》2000)第 2.3.13章关于牛海绵状脑病的诊断技术规定制定的。本标准与该文件的差异是：
本标准中除症状描述（临床诊断)外，采用该文件规定的两项主要技术即组织病理学诊断和免疫组织化学诊断技术，其他推荐技术未采用；由于该《手册》对上述两项技术的具体操作程序未作规定，本标准采用了OIE传染性海绵状脑病瑞士参考实验室(OIE TSE Reference Laboratory,Institute of Animal Neurology,Universi-ty of Bern,Switzerland)的操作程序；一本标准在文字表述上按照GB/T1.1一2000《标推化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》规定和汉语习惯编写。
本标准的附录 A、附录 B、附录 C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准主要起草人：王志亮、刘雨田、邹艳丽、王树双。276
1范围
牛海绵状脑病诊断技术
本标准规定了诊断牛海绵状脑病(BSE)的技术要求。GB/T 19180--2003
本标准适用于牛海绵状脑病的诊断；也可用于其他动物的传染性海绵状脑病(TSE)的诊断。2临床诊断
BSE病牛临床症状各种各样，病程多为数月至一年，最终死亡。当病牛出现以下全部或部分症状而又不能确定为其他疾病时，应怀疑BSE的可能。2.1 行为算常
表现为不安、恐惧、异常惊或沉郁；不自主运动，如磨牙、震颤；不愿接触水泥地面或进人畜栏等。2.2感觉或反应过敏
表现为触、视、听三觉过敏。对颈部触摸、光线的明暗变化以及外部声响过度敏感，这是BSE病牛重要的临床表现。
2.3运动异常
病牛步态呈“鹅步”状，共济失调，四肢伸展过度，有时倒地，难以站立。2.4体重和体况
体重和体况下降。
其他动物的TSE临床症状不尽相同，但确诊应依靠实验室诊断。3实验室诊断
发现可疑病例后，应进行采样，送专门实验室检测。3.1采样
将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。用剪刀剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑。大规模监测时，可用专用工具从枕骨大孔处，取出延脑部分即可。
3.2固定
将完整的脑组织浸人10倍体积的固定液（配方见附录A）中固定。一周后更换固定液，再维持周。
3.3组织病理学诊断
3.3.1病料处理
3.3.1.1把固定好的脑组织取出，将大脑和小脑去除，横切脑干选取厚度为3mm～5mm的脑问部延髓、小脑后脚部延髓和前丘部中脑组织块，3.3.1.2将选取好的组织块放人新配的固定液中再固定周，其间更换固定液三次，并用水平摇床不断摇荡，以提高固定液的渗透力。3.3.1.3将固定好的组织块放人流水中漂洗24h。3.3.1.4放人下列不同浓度的酒精中脱水：a）75%酒精中2h;
b）85%酒精中2h；
c）95%酒精中2h；
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d）95%酒精Ⅱ中2h；
e）100%酒精I中2h；
100%酒精Ⅱ中2h。
3.3.1.5放人下列香柏油和二甲苯中透明：香柏油中12h；
二甲苯Ｉ中１h;
二甲苯Ⅱ中１h。
3.3.1.6按下述方法浸蜡：
a）软蜡中 40 min;
b）硬蜡中2 h。
3. 3. 1. 7
将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，冷却过夜。3.3.1.8将石蜡块切成5μm厚的切片，用干净的载玻片贴片。3.3.1.9烤片24h以上。
3.3.2H-E染色
3.3.2.1试剂配制：见附录B。
3.3.2.2操作步骤如下：
二甲苯I中10 min；www.bzxz.net
二甲苯Ⅱ中 10 min；
100%酒精I中2 min；
100%酒精Ⅱ中2min；
95%酒精I中2min；
95%酒精Ⅱ中2min;
85%酒精中2 min;
75%酒精中2min；
自来水洗2min；
哈里斯酸性苏木精12 min；
自来水漂洗2min；
酸性酒精10s；
自来水漂洗5min；
饱和碳酸锂蓝染30s；
自来水漂洗10min;
75%酒精中2min；
85%酒精中2min;
95%酒精伊红液中复染1min；
95%酒精中2min;
100%酒精I中2min；
100%酒精Ⅱ中2minz
二甲苯I中2 min;
二甲苯Ⅱ中 2 min。
用中性树胶封片
结果观察
在光学显微镜下（10×1010×40)观察切片，若被检样品脑干灰质区特别是脑闫部位的孤束核、迷走神经背核、三叉神经脊束核等处的神经元核周质或神经纤维网胞浆中出现双侧对称性海绵状空泡病278
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变，且空泡呈规则的圆形或圆形，周边整齐，则可判定为BSE感染。在正常情况下，动眼神经核和红核处的核周质也可能有少量空泡出现，但不呈双侧对称，应注意区别。若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡病变，则用免疫组织化学方法做进一步诊断。3.4免疫组织化学诊断
3.4.1固定病料的处理
周3.3.1。
3.4.2试剂配制
见附录C。
3.4.3操作方法
3.4.3. 1同3.3.2.2a)~i)。
3.4.3.2PBS洗三次，每次5min。3.4.3.3将蛋白酶K缓冲液水浴至37℃，加入蛋白酶K，并立即将切片放人，确保切片全部漫入，消化15 min。
3.4.3.4在一个不锈钢饭盒中倒入刚煮沸的蒸馏水，并立即将切片放人盒中，确保切片完全浸人水中，盖好盒盖，在121℃（约103kPa）条件下高压蒸汽处理20min，然后自然冷却。3.4.3.5PBS洗三次，每次5min。3.4.3.6甲醇-双氧水中室温处理5min。3.4.3.7PBS洗三次，每次5min。3.4.3.8洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加5%的正常猪血清，确保组织全部覆盖，放人湿盒中室温作用20 min。3.4.3.9将切片放人1：800稀释的兔抗牛PrP抗体溶液中，确保切片完全浸人，37℃作用4h。也可用1：1000的免抗牛PrP抗体溶液37℃过夜处理。3. 4.3. 10 PBS洗三次,每次 5 min。3.4.3.11洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加DAKO试剂盒（见第C.6章）中BottleA的溶液，确保组织全部覆盖，放人湿盒中室温作用10min。3.4.3.12PBS洗三次，每次5min。3.4.3.13洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加DAKO试剂盒中BottleB的溶液，确保组织全部覆盖，放人湿盒中室温作用10min。3.4.3.14PBS洗三次，每次5min。3.4.3.15将切片在蒸馏水中放1 min～2 min。3.4.3.16洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加DAKO试剂盒中BottleC的溶液，确保组织全部覆盖，放人湿盒中室温作用5min～10min。3.4.3.17将切片在蒸馏水中放1min～2min。3.4.3.18以专用封片剂封片。
3.4.4结果判定
在光学显微镜下（10×10，10×40）观察切片，结果判定如下：a）阳性结果：在阳性对照切片染色结果正确的条件下，若被检样品脑干灰质区特别是脑部位的迷走神经背核、孤束核和三叉神经脊束核等处出现双侧对称性紫红色染色颗粒，则该样品判为BSE阳性。
h）阴性结果：若被检样品脑干灰质区未出现紫红色染色颗粒，则判为BSE阴性。279
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氯化钠
蒸馏水
40%福尔马林
混勾即可。
附录A
（规范性附录）
固定液
10%福尔马林生理盐水固定液的配制900 mL.
附录B
（规范性附录）
组织病理学诊断(H-E染色)的试剂配制1哈里斯酸性苏木精染液
B.1.1配方
苏木精
无水乙醇
蒸馏水
氧化汞
冰乙酸
钾明矾
B.1.2配法
200 mL
先将苏木精溶于无水乙醇，然后将钾明矾和蒸馏水煮沸溶化，去火速加人苏木精无水乙醇溶液中，再去火，立即加人氧化汞煮沸，迅速冷却后加入冰乙酸，过滤使用。B.2
酸性酒精
在100ml.的70%或80%酒精中加人0.5mL或1mL的浓盐酸。B.3
碳酸锂饱和水溶液
碳酸锂2g加100mI蒸馏水，充分溶解。B.495%酒精伊红液
伊红0.5g加人100mL95%酒精中配制。280
C.1蛋白酶K缓冲溶液
C.1.1配方
1 mol/L Tris-HCl(pH8. 0)
0. 1 mol/L CaCl2
蒸馏水
C.1.2配法
附录C
（规范性附录）
免疫组织化学诊断的试剂配制
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先将 Tris-HCl、CaCl，和蒸馏水混匀。用前在 37℃水浴中加人蛋白酶K(17uL)。C.2甲醇-双氧水（使用前 5 min 配）甲醇
H20,(30%)
C. 3 0. 1 mol/L PBS(pH7.4)
加水800mL溶解，调pH至7.4，加水至1000mLC. 45%正常猪血清(NSS)
0. 1PBS(pH7.4)
C.5免抗牛PrP抗体（或PrP单克抗体）1：800的稀释溶液（或PrP单克隆抗体）PBS(pH7.4)
兔抗牛PrP抗体
1：1000的稀释溶液（或PrP单克隆抗体）PBS(pH7.4)
免抗牛PrP抗体
C. 6 DAKO ChemMaterM Detection Kit/AECBottleA：生物素标记的抗鼠和抗兔免疫球蛋白BottleB:亲和素辣根过氧化物酶结合物BottleC:AEC/H,O2底物溶液
200μL
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