【国家标准(GB)】 传染性囊病诊断技术

ICS 65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T19167—2003
传染性囊病诊断技术
Diagnostic techniques for infectious hursal disease2003-06-02发布
中华人民共和国
国家质量鉴督拾验检技意局
2003-11-01实施
GB/T19167--2003
传染性囊病（IBD)又名鸡传染性法氏囊病、腺上囊炎、甘布罗病，是由双RNA病毒科离双RNA病毒属的传染性囊病病毒（IBIV)引退的鸡和火鸡的一种急性、高度接触传染性疫病。本标准参考了世界动物卫生组织［WorldOrganizationforAnimalHealth（英），OfficeInternatianldes Epizokoitiest法),OIE的《哺乳动物、禽,密蜂 A 和 R类疾病诊断试验利疫苗标准手册\所推荐的方法。
本标雅的附录A为规范性附录。
本标雅由中华人民共和国农业部提出。本标推即全动物检疫标准化技术委员会归口。本标推由北京农林科学院商牧兽医究所负责起常，山广西兽医研究所协作起节。木标准主要起草人：刘有鼻、刘爵、周蛟,姚炜光、张方亮、贺荣莲、是健敏、兰美益.黄红梅、痔冬福、韦志静。
传染性囊病诊断技术
GB/T19167—2003
本标准规定广传染性囊病病毒的病原分离、抗源的检测和检测特异性抗体的琼脂凝胶免疫扩散试验、病毒血清岸中和试验、酶联免疫吸附试验的技术婴求。本标推适用于传染性囊病的诊断与检疫。2病毒的分离及其鉴定
2.1材料准备
火菌纽织研磨器、离心机、37℃温箱、孵化器、灭菌吸登、橡胶啵头火菌小瓶、灭菌6#计头、火菌部射器、石，
2.2病料的采集和处理
来集具有病变的新鲜法氏囊，用加有抗生素(3000IL/ml.青掌素和3000P/ml.链辑素）的胰蛋白酶磷酸缓冲液或生理盐水制或20%的组织匀浆液，在37℃作用30mint~~60 tmit,1500 T/mi离心20 rit,收集上清液。经菌检培养为例性后作为按种树料。2.3鸡胚接种
2.3.1接种
将收集的上清液以每只0.21m.的量经绒毛展衰膜接种9H龄～11日龄无传染性囊病母源抗体鸡胚或SPF鸡胚（无特定雕库鸡班）：接种后用石蜡封任接秤孔，37℃孵育，每无照蜜检查，荐去241：内死亡的鸡胚。
2.3.2鸡胚剖检结果判定
2.3.2.1标推IBDV分离物接种后判定:标痛的ILLDV分离物接种鸡胚肩3 d-~5 d可致鸡胚死亡。死亡鸡胚充血，羽毛囊，趾关节和大驱脑有血斑性血。肝脏多可见坏死，也可见色似熟肉样。2.3.2.2IBDV变异袜分离物接种)i判定：IBDV变异株经绒毛尿囊膜接种鸡胚，一般不敏死鸡胚，接种后5d～6 d剖检，可见鸡脏大脑和腹部皮下水熙、发育迟缓,呈灰白色或奶汕色，肝脏常有胆汁着色或坏死,脾睡遍常肿大2倍～3倍·恒颜色无明显变化2.4易感维鸡接种试验
2.4.1接种
取2. 2述及的病料上清被 0. mI.,经点眼、口最感染5只 14 日龄～21封龄无 IBDV母源抗体将或SF鸡，同时设健康对照组。接税3d后将鸡剖杀，检查法氏囊及孵脏。2.4.2剖检接种结果
2.4.2.1标准IBDV接种结果：接种后偶见鸡死亡，削检可见接种鸡法氏囊水肿，色黄，有时可见出血。脾脏有时可见轻度脚大,衰而有或色点状病变。健康鸡则正常，2.4.2.2IRDV变异株接种结果：接种后不出现死亡，3d剖检可见法氏赚菱缔、质度硬，脾脏可见肿大1倍~-2倍。键康鸡谢正带。
2. 5 IBD 病毒的鉴定
2.5.1琼脂凝胶免疫扩散(AGII))试验用已知的特异性的鸡传染性囊病标准阳性血清，用分离株的法氏囊勾浆制备待检抗原，间时制备正常法氏境勾浆作对照抗原，按AI常规法滴加抗原和清进行扩散，如在抗原孔和血清孔之间出现凹色沉淀线者判分离物为阳性。
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2.5.2直接免疫光法
2.5.2. 1材料及方法
2. 5. 2. 1. 1高免血清
采用CJ801株择制备的高免血清，经AGII)测定效价为 1：128 以1:,经中和试验谢定在 21°(1: 208 4)以上
2.5.2.1.2直接荧光抗体的制备
深用33%饱和毓越钱析，沉凝免疫球蛋自，经透析并通ScphadexG50性去接离了，用紫外分光光度计测定球蛋白淤度在 20 mR/mL-~25 mg/mL左右，以异硫氢酸荧光素(FITC)按 1%量采用热标记方法标记，再经透析和SephadexG50柱层析-收巢荧光抗体，保存于=20℃冰箱许用。2.5.2.1.3标本的制备及染色
取分商株法氏囊制成冰冻切片或用其组织制戒压片，得自然干燥，以4汇保存的冷再酮溶液固定1C min,0.1 mol/1. pH7.2磷酸盐缓冲波冲洗两饮.蒸馏水冲洗一→次,风干店用 1:8--1 16荧光释液为工作被，滴如在切片上置湿盒中，在 37C温箱中静置 30 mi.再终磷酸盐缓冲液,蒸缩水冲洗风于，滴加甘油缓冲液封固、镜检。2.5.2.2键检及判定标准
用荧光显微镜检查。采用法氏衰冰冻切片为荧光诊断标本,法氏囊病锋侵害法氏衰后主要表现在淋巴小叶的髓质部。首先在淋巴滤胞胞炭中发出黄绿色荧光题粒，胞核位于中间为暗色不发光。感染初期常见到“光轮”样给树的琳巴感腋，感染最严重时世于大情病萨在泡聚中复制发出强荧光的无斑。玻质不发光：具有上述淋巴图像称为特异性荧光，判为阳性。根据荧光强弱，荧光细跑的数量及荧光结构的猜晰度可判为“十}十1、！！→、一、+”。淋巴小叶结树完整面清晰,又不发荧光考判为阴性。3琼脂凝胶免疫扩散
3.1材料准备
3、1.1鸡传染性囊病诊断抗原和标准阳性批清。3.1.2琼脂板制备方法见附录 A。3.1. 3被检清样品：被检鸡血清麻新鲜，分离后56灭活30min,采血后分离的血清可以当天使用，也可置一20℃保存备用
3.2操作程序
3.2. 1打孔
反应孔按面好的七孔期案打孔，将面好的七孔断案改在有琼脂板的平函下,按脏图案在固定位置用不锈小管打孔，[心孔径3m,外周孔径3m外周孔与中间扎间距3i，打孔时切下的琼脂可以吸出也可以用针头挑出，打好，在精灯上适当邸热平瓜底部，惊脂与玻璃平服贴紧，鞋免于打孔时导致的琼脂与平而脱离。
3. 2.2加样
3. 2. 2. 1抗体的定性与定量测定岩是做定性试验，不需要稀血清，只将血清样品直接加人琼脂板孔中，但若要定单测定血清沉流抗体的滴度,可以在21孔或96孔V形培养板上稀释血清·各孔预先加人50μL的PBS然后倍比稀释而满·最更赖吸头由高稀释度开始加样。3,2.2.2抗原及血清在孔内的添加如图所示，中央孔了加抗原，14孔加阳性血清，2、3、，6孔加被检血清，各孔刻孔满为止。如果定量检测血清的沉凝抗体，采用中央孔了加抗原，周捆6孔依饮期人各不阅帮释度的血样品。在琼瞻板上另做二孔，打法及问距同前，分别加人阳性血清和抗原，设立阳性对照。加盖将平血暨于避盒或容器中，在37%条件下反应，逐日观察，72终判。3.3结果判定
3. 3. 1定性捡测
图1琼脂扩散反应孔的布局
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被检血清我与抗原孔之间形成致密沉淀线者，或者阳性血消的沉淀线向耻邻的被检血消乳内测弯者，此裁检孔血清判为阳牡，
被检血清孔与抗原孔之间不形沉淀线，此被检血清判为阴性，3. 3. 2定量检测
当标准阳性爬消孔与抗原孔产牛致密沉淀线后，被检血清能与抗源产生沉涟线的最高稀释度即为该被检血清沉淀抗体效价。
4病毒血清微量中和试验
4.1材料
4. 1.1器材:43孔或36孔有盐的聚米乙烯微鼠细胞增养板洗净后烘干,采用紫外线距离 30 cm 照射盖内侧培养板孔1h或射线辐射消毒，多道，单道固定或可调式微量取样器，规格为5μL～50μL、50ul~-200ul..并配以相应规格经高压消再的塑料吸头2cm宽的涤纶透明胶带，4.1.2细脑：鸡胚成纤维细胞。
4, 1. 3血清;IBI>V 阳性血清和阴性血清均由 SPF 鸡制备。被检血清为采自受检鸡的不腐败、不溶血、不加抗凝剂和防腐剂的准清、在试验前5Gt水浴火活30min。4.2操作程序
本试验采用俩极法，即\板1\作血清-摘毒感作，*板2”用作正式试验4. 2.1取 75 μLEarles被加到\板I\件孔，第!0列加75 μLEarles液作细脑对照。4.2. 2取25μL被检而血清分别加到A,B,C:行的第 1孔. 分别作 1：4倍系列稀释至第8孔。4. 2. 3取25 μ1. 性而清加到 L)行的第1 孔,取 25 L 阴性脏清加到 D行的第 5孔+分别按上法稀释(即1～4为阳性对照,58孔为阴性对照)。4.2.4除第10列外,取25μl.含200T(I：/25uI.的（J80病荐，然后置微量振荡器上振荡混勾，37℃感作 45 min~60 min。
4.2.5用取样器以20.含100万/mL鸡胚成纤维细跑加到=板2*各乱内4.2.6用取样器分别吸取病毒血清混合物转移到\板2\相应各孔内，每份血清接种4孔，每孔25.4.2.7用2cm宽的涤纶透明胶带封最，搬药混，置37℃温箱培养72h-96h后，显微镜下观察细跑病变情况。
4.3结果翔定
1：8以下为阴性：
1：32 以上判为阳性：
1116判为可既,隔调后采血测定抗休价仍为1：16或更低则为阴性。酶联免疫吸附试验
5.1鸡传染性法氏囊病病毒抗原的检渊5.1.1材料准备
5.1.1.1被检样品：送检的病、死鸡法氏髓。GB/T 19167--2003
5.1.1.2标准阴性样品标准阴性样品为键康鸡法氏囊纽织浸液。5. 1.1.3 MR5000 酶标仪。
5.1.2操作环境
10℃-30℃。
5.1.3操作程序
5.1,3.1被检样品的处理；将送检的病、死鸡法氏囊剪辞研磨.按：5董加白来水，制成组织浸液，静置 5 min,取 上消液进行检测。5.1.3.2如样：用小塑料管(中 5 mm,长 500 mm)吸取上述被检法氏囊的组织没液,加到骤裘乙烯酶标板的小孔内1滴(50μ1.以下同),每1个样品用1个礼，同时设1个孔作对照,用小塑料管吸取标准阴性样品，向对照孔内滴人1滴，静置2min。5.1.3.3洗涤：再向加样的小孔内滴人洗液 1滴之后,接着用白来水滴满小孔，洗2次，每次均充分甩下。
5.1.3.4加酶结合物；向加样的小孔内滴人酶标记结合物1滴，静置2mitr5.1.3.5洗涤：同5.1.3.3的方法，用白米.水洗5次。5.1.3.6显色，向加样的小孔内滴入底物1滴，紧接着滴人显色液1滴，在5min内判定结果，5. 1.4结果判定
5.1.4.1观察颜色的判定
孔内的液体显蓝危者，判为阳性。孔内的液体呈无色者，判为阴性。5.1.4,2酶标仪检测的判定
5.1.4.2.1加终止液，加显色液后5min，用小塑料管吸取终止液，间加样的小孔内滴人1滴：用酶标夜测定（)n的数值。
5. 1. 4.2.2判定:
01).=.105定为临界值。
OD0.105判为阳性。
O4s≤0.105判为阴性。
5. 2鸡传染性法氏囊病病霉抗体的检测5.2.1材料准备
5.2.1.1被检样品；送检的鸡而清。5.2.1.2标推抗原:标准抗原为鸡传染性法氏衰病囊毒抗原。5.2.2操作环境
同5.1.2,
5.2.3操作程序
5.2.3.1被检详品的处理：用吸管吸取被检血消0.3ml..置于小瓶内，再用1支吸管吸取标推抗息(.1mL，加人同一小瓶内，使二者充分混合，静置5min。5.2.3.2对照样品的处理：用假管吸取生理盐水0.1mL，置于小瓶内，再用另1支吸管吸取标准抗原0. 1 mL,加人同一小瓶内,使三者充分混台,静置 5 min,5.2.3.3加样：用小塑料管分别吸取上述处理好的被检样品和对照样品·分别加到茉乙烯酶标板的小孔内人1满，蒋含样品用1个孔.静鹭2min，5. 2. 3. 4洗涤:荷 5. 1. 3. 3。5.2.3.5加酶结合物：同5.1.3.4。5.2. 3. 6洗:同 5. 1. 3. 3。
5.2.3.7显色同5.1.3. 6。www.bzxz.net
5.2.4结果判定
5.2.4.1观囊颜色的判定
孔内的液休呈无色者，判为阳性。孔内的休是蓝色者，判为阴性，5.2.4.2薛标仪检的判定
GB/T 19167-2003
5.2.4.2.1加终止波，加显色液后5min，用小塑料管吸取终液，向加荐的小孔内滴入1滴，用酶标仪测定OD45e的数值，
5.2、4.2.2判定：
004-.0. 105
判为阳性：
0, 401)5 20. 105
判为弱阳性。
(D0.4判为阴性。
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(规范性附录)
琼脂凝胶的制备
试验中琼脂制备方法为琼脂糖1g，氯化钠8g，苯酚0.1ml.蒸馏水100mL。先将琼胎糖加到蒸增水中，加热熔化后再加人氯化钠、苯酚，最后用5.6%碳酸氢钠调pH值为6.8~7.2，将溶化并混勾的琼脂缓慢倒入平放的洁净的玻璃平血中,平中琼脂厚度要求8 T1m,玲却凝固后备用。
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