【农业行业标准(NY)】 肠病毒性脑脊髓炎诊断技术

ICS 11. 220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T568-2002
肠病毒性脑脊髓炎诊断技术
Diagnostic technigues for enterovirus encephalomyelitis2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T5682002
本病属于细小核糖核酸病毒科的肠道病毒属肠道病毒1型（简称PEV）。病毒主要感染动物的中枢神经系统并繁殖，使运动神经节细胞变性，导致非化脓性脑脊髓炎。此病多见于哺乳仔猪和断奶仟猪，成年猪多为隐性感染，引起发烧、厌食、共济失调、四肢麻痹和痉挛，该病的发病率和死亡率都很高，造成严重的经济损失。
肠病毒性:脑脊髓炎（Enterovirusencephalomyelitis），曾称做捷中/塔尔凡氏病（Teshen/Talfandisease），是猪的一种严重病毒性传染病，被世界动物卫生组织［World（)rganization forAnimalHealth（英），OfficeIntentionaldesEpizootic（法），OIE和我国农业部分别列为B类和二类动物疫病。本标准是依据（)IE《诊断试验和疫苗标准手册》（2000年版）（ManualofStandardsforDiagnosticTestsandVaccincs，2000)第2.6.3章规定的主要技术制定的。两者的主要差异是：本标准根据本国和国外实践经验规定了使用主要致病原PEV.1型病毒作为抗原，未采用2-13型PEV，未采用酶联免疫吸附（ELISA)技术；-本标准根据本国实践经验将操作程序更加具体化。本标准附录A、附录B是规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准出全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标推主要起草人：封启民、李昌琳。5.12
1范围
肠病毒性脑脊髓炎诊断技术
本标准规定了（猪）肠病毒性脑脊髓炎诊断技术要求。NY/T 568-2002
本标准适用于(猪)肠病毒性脑脊髓炎的病原鉴定及流行病学检查进出检疫和免疫抗体的检测。2临床症状检查www.bzxz.net
临床上分为四个型，即急性型、亚急性型、慢性型和温和型，此外还有无症状仅检出抗体的隐性感染，根据临床症状和病理变化(见第3章)可作出怀疑性诊断。该病潜伏期为2d～28 d。
2.1急性型
病猪首先出现体温升高，多在40.0C～41.1C左右或更高，病猪表现为厌食、倦、呕吐、严重鼻炎、腹泻及行动失调。发病1d～2d后，体温降至正常，出现中枢神经系统症状，如寒战、感觉过敏、抽搐、共济失调、四肢僵直（特别是后肢）、角弓反张和昏迷，接着发生麻痹，病猪呈犬坐姿或于一侧卧地，前肢作划水样，受声响或触摸刺激时，可引起四肢不协调运动，或角弓反张，也可见面部麻痹和失音。病猪发生便秘。传染性脑脊髓炎的病程发展迅猛，瘫痪出现后的2d~3d.就有80%~~95%的病猪可因呼吸中枢麻痹而死亡，有些病猪死于吸人性肺炎，有些病例急性期之后食欲有所恢复，但见消瘦并伴有麻痹症状。
2.2亚急性型
病程为6 d～8 d,症状与急性型相似，但较轻缓，死亡较少。2.3慢性型
多发于成年猪，病程为几周到几个月，特征为沉郁、行动困难，尾部麻痹、前肢瘫痪，其中有20%的病猪因肺炎、褥疮、败血症等原因死亡。2.4温和型
声力较低的毒株引起，症状较轻，发病率和死亡率较低，主要侵害仔猪。病初体温升高，运动失调。这些症状大多在几天内消失，但有些病猪则随后出现兴奋、发抖、平衡失调、运动失调、最后麻痹等症状3组织病理学检查
组织学诊断采集的样品有大脑、小脑、间脑、延髓和颈腰部脊髓。这些样品用甲醛固定，制成切片，用常规组织学方法染色，显微镜检查可发现血管周围非化浓性淋巴细胞浸润，浸润现象限于灰质部，偶尔波及自质部。间脑和小脑有明显的变化；大脑半球较轻，病的后期神经元细胞变性、并被胶质结缔组织细胞代替；常见非化浓性脑脊髓炎，特别是在小脑部分。4病毒分离及鉴定
4.1材料准备
4.1.1病料的采集
将发病期的猪扑杀，用无菌操作法取脑和脊髓样品，放在pH7.2的磷酸甘油缓冲液（PBS)中（PBS543
NY/T5682002
和针油等量混合）配方现附录A。4.1.2细胞
PKi5或IBRS，猪肾细胞，至生长良好的单层细胞。4.1.3细胞培养液
配方见附录3。
4.2病料的处理
4.2.1处理
4.2.1.1将织块切碎，在研钵中，用PBS制成质量浓度为10%的组织悬液，：70C冻融两次。4.2.1.2以5000r/min离心30 min。4.2.1.3取上清，以1：1的比例加三氯甲烷，充分震荡，混合1h，置于4（＇14h～16h。再以同样速度离心30min，从水相底部取出病毒接种液。4.2.1.4每毫升加人1000IU青霉素和1000ug链霉素，室温静置1h。4.2.2病毒分离操作方法
单层原代猪肾细胞或猪肾传代细胞、如PK1s或IBRS2.最适合分离本病毒。a）取10支单层细胞培养管.做上标记，并弃去营养液。b）每算加0.！m!.可疑组织悬液，加塞后，效在旋转培养箱中培养、1h后，弃去接种物.每管用PBS液洗涤3次。
c）最后每管加1mL不含犊牛血清的维持液，再把培养管放在加旋转培养箱中，37C培养。每天用显微镜观察细胞，如果有猪传染性脑脊髓炎病毒存在，则3d～4d可看到典型的细胞病变（CPE），其特征是出现小病灶，病灶中的细胞圆缩，有折光性。进一步培养，（PE增多直到所有细胞脱壁。经过数代培养，病毒繁殖良好，一般在24h～48h届出现完全的CPE，下．·步就可进行病毒分离物的鉴定。
4.2.3分离物的鉴定
4.2.3.1病莓中和试验
从细胞培养物中收获的分离物用维持液从10~1~10°‘作10倍连续稀释.两排孔加稀释的分离液，第一排孔加等量的10倍稀释的标准血脊：第二排孔按同样稀释度加人等量阴性盘清。混合物置4C孵育过夜，然后，接种到旋转培养管或微量板的孔中，72h后根据细胞病变进行判定。判定标准：如果与阳性血清作用的分离物滴度比与阴性血清作用的滴度至少低103以上，即可判为分离物为猪传染性脑脊髓炎病毒。4.2.3.2间接荧光抗体试验
操作步骤：
a）将分离物接种在布满单层猪肾细胞的盖玻片上，同时进行阴、阳性样品对照试验。b）12h后将细胞玻片（盖玻片）取出，用PBS冲洗3次，用冷内酮固定5min。c）将细胞玻片放人湿盒内，加入已用PBS作1：10稀释的兔或猪抗猪传染性脑脊髓炎病毒高免血清。
d）盖好湿盒.置37孵育60min。
e）取出细胞玻片，用PBS冲洗3次，然后加人异硫氰荧光素标记的抗兔或抗猪山羊血清（预先测好L作浓度）、最后置37（孵育30min。）细胞玻片用P13S冲洗3次.风于，用0.1mo1/1.pH8.6的磷酸甘油缓冲液封片。细胞玻片经处理后。用荧光显微镜检查，首先观察对照片，确定特异性荧光.荧光为苹果绿色，并位于细胞浆中和细胞核外周。
5微量血清中和试验
5.1材料准备
NY/T568—2002
5.1.1器材：灭菌的96孔细胞培养板，50μL、100μL、300μl微量移液器，灭菌的塑料滴头、无毒透明胶带、灭菌塑料锥形具塞离心管，倒置显微镜。5.1.2病毒抗原，标准阳性血清，标准阴性血清。5.1.3PK或IBRS细胞。
5.1.4细胞培养液：配方见附录B。5.2操作方法
5.2.1血清56C水浴中灭活30min。5.2.2用细胞培养液将待检血清在96孔微量细胞培养板中从1：2开始作2倍系列稀释至1：256，每个稀释度加4孔.同时设立阳性血清和阴性血清对照，每孔各加50μl.。5.2.3用细胞培养液预先将原种病毒稀释成含100TCID5/50μLT作液，每孔加50μl，震荡均匀。5.2.4将微量板加盖后，置于37C二氧化碳（CO2)培养箱中和1h～1.5h。5.2.5病毒回归滴定，即将病毒工作液用稀释液作4个10倍系列稀释（10：10*），每个稀释度作4孔，每孔加50μl另加稀释液。
5.2.6每孔加100μl.细胞悬液（细胞数约为5×10%/μl,）。5.2.7同时设立阳性血清对照：1：4稀释血清50μl+50μl.病毒工作液十100μI.细胞悬液。阴性而清对照：1：4稀释血清50μl.+50ul.病毒T作液+100μl细胞：正常细胞对照：细胞悬液100ul+细胞培养液100μl悬液。
5.2.8将微量板震荡摇匀后密封，置37C.氧化碳（CO,)温箱培养2d~7d。5.3结果判定
用倒置显微镜检查微量板孔中的特异性细胞病变（CPE）.48h~～72h就可以判定结果，当病毒回归滴度结果确定在30TCLD50～300TCLDso之间；阳性血清对照孔不出现病变，阴性血清对照孔出现细胞病变；不加病毒的细胞孔正常，方可判读结果。判定结果：当被检血清中和病毒的稀释度在1：8或更高，则判为阳性。5.15
NY/T568--2002
附录A
（规范性附录）
0. 01 mol /L pH7. 2 磷酸盐缓冲液(PBS)磷酸氢二钠(NazHPO，·12H,O)
磷酸二氢钠(NaH,P0,·2H,O）
氯化钠（NaCI）
加蒸馏水至3000ml.。
以总量100ml.计：
犊牛血清
谷氨酰胺
青霉素
链霉素
附录B
（规范性附录）
细胞培养液的配制
0. 3 mg/mL
200IU/mL
200 μg/mL
用5.6%碳酸氢钠(NaHCO)调pH7.0～7.2。516
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