【国家标准(GB)】 婴幼儿配方食品和乳粉 维生素A、D、E的测定

GB/T 5413.9—1997
测定维生素A、D、E的方法很多，但广为采用的是高压液相色谱法，方法快速、准确，并避免了三种成分的相互干扰。
本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人：杨金宝、王芸。255
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
维生素A、D、E的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children-Determination of vitamin A,D,E content1范围
本标准规定了用液相色谱法测定维生素A、D、E的方法，本标准适用于各种婴幼儿配方食品和乳粉中维生素A、D、E的测定。2方法提要
GB/T 5413. 9--1997
样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，经（用)石油醚萃取后，用高压液相色谱，紫外检测器定量测定。
3试剂
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1
高峰氏淀粉酶（Taka-Diastase）。3.2异丙醇：色谱纯。
焦性没食子酸的乙醇溶液：15g/L。3.4
氢氧化钾溶液：质量比为100：50。3.5
石油醚：沸程30～60℃。
甲醇：色谱纯。
3.7正已烷：色谱纯。
3.8环已烷：色谱纯。
3.9维生素A、E标准溶液
3.9.1维生素A标准贮备液，含维生素A100μg/mL的甲醇溶液。称取10mg的维生素A，用甲醇定容于100mL容量瓶中。3.9.2维生素E标准贮备液，含维生素E400μg/mL的甲醇溶液。称取 40mg的维生素 E,用甲醇定容于 100mL 容量瓶中。3.9.3维生素A、E标准工作液，其中维生素A的浓度为2μug/mL，维生素E的浓度为20ug/mL。取1mL维生素A标准贮备液（3.9.1)和2.5mL维生素 E标准备液（3.9.2)于50mL容量瓶中，用甲醇溶解。
3.10维生素D标准溶液
3.10. 1维生素 D,标准贮备液,含维生素 D,100μg/mL 的甲醇溶液。称取 10mg的维生素 Dz,用甲醇定容于 100mL容量瓶中。3. 10.2维生素 D,标准贮备液,含维生素 D:100μg/mL的甲醇溶液。国家技术监督局1997-05-28批准256
1998-09-01实施
GB/T 5413.9-1997
称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。3. 10. 3维生素 D标准工作液,其中维生素 Dz、维生素 D3的质量浓度均为 1μg /mL。取维生素D,标准贮备液1mL，维生素D;标准贮备液1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容。4仪器
常用实验室仪器及：
4.1平底烧瓶：250mL。
4.2分液漏斗：500mL。
4.3旋转蒸发器。
4.4高压液相色谱仪：具有可变波长的紫外检测器、数据处理系统或记录仪。5操作步骤
5.1样品处理
5.1.1含淀粉的样品
准确称取10g样品，放入250mL平底烧瓶中，加入1gTaka淀粉酶（3.1），再加入30mL45~~50℃的蒸馏水，混合均勾后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置45℃烘箱内30min。5.1.2不含淀粉的样品
准确称取10g样品，置于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。5.2测定液的制备
5.2.1于上述处理过的样品溶液中加入100mL的没食子酸乙醇溶液（3.3），充分混勾后加50mL氢氧化钾溶液（3.4），在蒸汽浴上连续回流30min后，立刻冷却到室温。5.2.2将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中。
5.2.3于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚（3.5），盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min。在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中。重复上述萃取过程二次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40C和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干（绝不允许蒸干）后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。5.2.4从上述容量瓶中取2mL石油醚溶液放入试管A中，再取7mL石油醚溶液放入另一试管B中，分别用氮气将试管A和B中的石油醚吹干，石油醚溶液放于A中加5mL甲醇，用来测定维生素A、E，试管B中加1mL正己烷，用来测定维生素D。5.3测定
5.3.1维生素A和E的测定
5.3.1.1仪器条件
色谱柱：25cm×4.6mm，ODS柱或具等同性能的色谱柱。流动相：甲醇。
流速：1.OmL/min
灵敏度：0.005AU/MV。
波长：维生素A，325nm；维生素E，290nm。5.3.1.2注射50μL维生素A、E标样（3.9.3）和50μL样品溶液（5.2.4试管A中），得到标样和样品溶液中维生素A和E的峰高或峰面积。5.3.2维生素D的测定
5.3.2.1测定液的制备
a）仪器条件bzxz.net
色谱柱；30cmX4mm，硅胶柱。
GB/T5413.9—1997
流动相：环已烷（3.7)与正已烷（3.8)按体积比1：1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇（3.2）。流速：1mL/min。
波长：265nm。
柱温：20℃。
灵敏度：0.005AU/MV。
注射体积：200μL。
b）注射50μL维生素D标样和200μL样品溶液（试管B中），根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管C中,将试管C用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇(3.6)溶解。5.3.2.2测定步骤
a）仪器条件
色谱柱：25cm×4.6mm，Cig或具等同性能的色谱柱。流动相：甲醇。
流速：1mL/min。
柱温：20℃。
波长：265nm。
灵敏度：0.005AU/MU。
注射体积：50μL。
b）注射50μL维生豪D标准溶液（3.10.3)，注射50μL样品溶液（试管C中），得到标样和样品溶液中维生素 D 蜂面积或峰高。
6分析结果的表述
样品中维生素A(IU /100g）m×10/2×5×3.33×100m
样品中维生素 E(IU/100g）=×10/2×5×100m
样品中维生素D(IU/100g)=×10/75×100×40m × 1 000
式中：c.—
进样液中维生素A、E或D的质量浓度，ug/mL；m
一样品的质量，g；
一进样液中维生素A、E或D的峰高(或峰面积)；A
一标样中维生素A、E或D的峰高（或峰面积）A.d
-标样中维生素A、E或D的质量浓度，μg/mL。计算结果精确至小数点后位。
7允许差
（2）
（4）
同一样品的两次测定值之差，维生紊A不得超过两次测定平均值的5%；维生紊D不得超过两次测定平均值的10%，维生素E不得超过两次测定平均值的5%。258
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