【国家标准(GB)】 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2，4？二硝基苯肼法)

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.86—2003
代替GB/T12392-1990
蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2，4-二硝基苯耕法）Determination of total ascorbic acid in fruitsvegetables and derived products-Flourometricmethod and colorimetric method2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T5009.86-2003
本标准第一法对应于ISO6557-1：1986《蔬菜、水果及其制品中抗坏血酸的测定方法》和AOAC967.22《维生素制品中总维生素C的微量荧光测定方法》。本标准与ISO6557-1和AOAC967.22的一致性程度为非等效。本标准代替GB/T12392—1990《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法（荧光法和2，4-二硝基苯肼法)》。
本标准与GB/T12392—1990相比主要修改如下：-修改了标准的中文名称，标准中文名称改为《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯肼法)》；
按GB/T20001.4一2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》对原标准的结构进行了修改。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。本标准主要起草人：王光亚、杨晓莉、田立新。原标准于1990年首次发布，本次为第一次修订。624
1范围
GB/T5009.86—2003
蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2，4-二硝基苯肼法）本标准规定了用荧光法和2，4-二硝基苯肼比色法测定食品中的抗坏血酸。本标准适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。本方法检出限：荧光法为0.022μg/mL，2，4-二硝基苯肼比色法为0.1ug/mL。线性范围：荧光法为5μg/mL～20μg/mL，2，4-二硝基苯肼比色法为1μg/mL～12μg/mL。第一法荧光法
2原理
试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的唔啉（quinoxaline），其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。3试剂
3.1偏磷酸-乙酸液：称取15g偏磷酸，加人40mL冰乙酸及250mL水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL。于4℃冰箱可保存7d～10d。3.20.15mol/L硫酸：取10mL硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200mL。3.3偏磷酸-乙酸-硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同3.1配制。3.4乙酸钠溶液（500g/L）：称取500g乙酸钠（CHCOONa·3H，O），加水至1000mL。3.5硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100mL乙酸钠溶液（3.4)中。临用前配制。3.6邻苯二胺溶液（200mg/L）：称取20mg邻苯二胺，临用前用水稀释至100mL。3.7抗坏血酸标准溶液（1mg/mL）（临用前配制）：准确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸-乙酸溶液(3.1)溶于50mL容量瓶中，并稀释至刻度。3.8抗坏血酸标准使用液（100μg/mL）：取10mL抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL，定容前试pH值，如其pH>2.2时，则应用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液（3.3)稀释。3.90.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75mL，磨溶后用水稀释至250mL。变色范围：
pH值等于1.2
pH值等于2.8
pH值大于4
3.10活性炭的活化：加200g炭粉于1L盐酸（1十9)中，加热回流1h~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110℃～120℃烘箱中干燥，备用。4仪器
4.1实验室常用设备。
GB/T5009.86—2003
4.2荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。4.3捣碎机。
5分析步骤
5.1试样的制备
称取100g鲜样，加100mL偏磷酸-乙酸溶液（3.1)，倒人捣碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或蓝色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释.使其pH为1.2。均浆的取量需根据试样中抗坏血酸的含量而定。当试样液含量在40μg/mL~100μg/mL之间，一般取20g勾浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL，过滤，滤液备用。5.2测定
5.2.1氧化处理：分别取试样滤液（5.1）及标准使用液（3.8）各100mL于200mL带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即试样氧化液和标准氧化液，待测定。
5.2.2各取10mL标准氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明\标准”及“标准空白”。5.2.3各取10mL试样氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明\试样”及“试样空白”。5.2.4于“标准空白”及“试样空白”溶液中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4℃冰箱中放置2h~3h，取出备用。5.2.5于试样”及“标准”溶液中各加人5mL500g/L乙酸钠液，用水稀释至100mL，备用。5.3标准曲线的制备
取上述“标准”溶液（5.2.5)（抗坏血酸含量10μg/mL)0.5、1.0、1.5和2.0mL标准系列，取双份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至2.0mL。荧光反应按5.4操作。5.4荧光反应
取5.2.4中“标准空白”溶液，“试样空白”溶液及5.2.5中\试样”溶液各2mL，分别置于10mL带盖试管中。在暗室迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发光波长338nm、发射光波长420nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算使用。6结果计算
见式(1)。
式中：
×F×1000
X试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；c由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，单位为微克每毫升（pg/mL）；m试样的质量，单位为克（g)；
V荧光反应所用试样体积，单位为毫升（mL）；F—试样溶液的稀释倍数。
计算结果表示到小数点后一位。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。626
8原理
第二法2，4-二硝基苯肼比色法
GB/T5009.86—2003
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色膝，根据在硫酸溶液中的含量与抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。
9试剂
9.14.5mol/L硫酸：谨慎地加250mL硫酸（相对密度1.84）于700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL
9.285%硫酸：谨慎地加900mL硫酸（相对密度1.84）于100mL水中。9.32,4-二硝基苯肼溶液（20g/L)：溶解2g2,4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸中，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。9.4草酸溶液（20g/L）：溶解20g草酸（HC,O）于700mL水中，稀释至1000mL。9.5草酸溶液（10g/L）：取500mL草酸溶液（9.4）稀释至1000mL。9.6硫脲溶液（10g/L）：溶解5g硫脲于500mL草酸溶液（9.5)中。9.7硫脲溶液（20g/L)：溶解10g硫脲于500mL草酸溶液（9.5)中。9.81mol/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。9.9抗坏血酸标准溶液：称取100mg纯抗坏血酸溶解于100mL草酸溶液（9.4)中，此溶液每毫升相当于1mg抗坏血酸。
9.10活性炭：将100g活性炭加到750mL1mol/L盐酸中，回流1h2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe+）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氮化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴人，如有铁离子则产生蓝色沉淀。10仪器
10.1恒温箱：37℃±0.5℃。
10.2可见-紫外分光光度计。
10.3捣碎机。
11分析步骤
11.1试样的制备
全部实验过程应避光。
11.1.1鲜样的制备：称取100g鲜样及吸取100mL20g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成勾浆，取10g～40g勾浆（含1mg~2mg抗坏血酸）倒人100mL容量瓶中，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。11.1.2千样制备：称1g~4g干样（含1mg~2mg抗坏血酸）放人乳钵内，加人10g/L草酸溶液磨成匀浆，倒人100mL容量瓶内，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。11.1.3将11.1.1和11.1.2液过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后，倾出上清液，过滤，备用。
11.2氧化处理
取25mL上述滤液，加人2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL20g/L硫腺溶液，混勾，此试样为稀释液。627
GB/T5009.86—2003
11.3呈色反应
11.3.1于三个试管中各加人4mL稀释液（11.2)。一个试管作为空白，在其余试管中加人1.0mL20g/L2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放人37℃士0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。11.3.23h后取出，除空白管外，将所有试管放人冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加人1.0mL20g/L2.4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10min～15min后放人冰水内。其余步骤同试样。11.485%硫酸处理
当试管放人冰水后，向每一试管中加入5mL85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。11.5比色
用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。11.6标准曲线的绘制
11.6.1加2g活性炭于50mL标准溶液中，振动1min，过滤。11.6.2取10mL滤液放人500mL容量瓶中，加5.0g硫腺，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20μg/mL。
11.6.3取5，10，20，25，40，50，60mL稀释液，分别放人7个100mL容量瓶中，用10g/L硫腺溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1,2,4,5,8,10,12g/mL。11.6.4按试样测定步骤形成膝并比色。11.6.5以吸光值为纵坐标，抗坏血酸浓度（μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。12结果计算下载标准就来标准下载网
见式（2）。
式中?
X—试样中总抗坏血酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；（2）
一由标准曲线查得或由回归方程算得“试样氧化液”中总抗坏血酸的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
试样用10g/L草酸溶液定容的体积，单位为毫升（mL)。F一试样氧化处理过程中的稀释倍数；m—试样的质量，单位为克(g)。计算结果表示到小数点后两位。13精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。628
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