【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 产气夹膜梭菌检验

ICS07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T4789.13—2003
代替GB/T4789.13-1994
食品卫生微生物学检验
产气荚膜梭菌检验
Microbiological examination of food hygiene-Examination of Clostridium perfringens2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T4789.13—2003
本标准对GB/T4789.13--1994《食品卫生微生物学检验产气英膜梭菌检验》进行修订。本标准与GB/T4789.13--1994相比主要修改如下：-按照GB/T1.1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。-修改并规范原标准中的“设备和材料”。本标准自实施之日起，GB/T4789.13—1994同时废止本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：卫生部兰州生物制品研究所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：王成怀、冉陆、付萍、姚景会。本标准于1984年首次发布，1994年第一次修订，本次为第二次修订。90
1范围
食品卫生微生物学检验
产气英膜梭菌检验
本标准规定了产气英膜梭菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中产气英膜梭菌的检验。2规范性引用文件
GB/T4789.13-2003wwW.bzxz.Net
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料
3.1冰箱：0℃~4℃。
3.2恒温培养箱：36℃士1℃。
3.3恒温水浴锅：46℃土1℃。
3.4显微镜：10×～100×。
3.5均质器或灭菌乳钵。
3.6厌氧培养装置：常温催化除氧式或碱性焦性没石子酸除氧式。3.7灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。3.8灭菌试管：16mm×160mm。
3.9灭菌平血：直径90mm。
3.10灭菌锥形瓶：500mL。
4培养基和试剂
4.1疱肉培养基：GB/T4789.28-2003中4.67。4.2亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS)：GB/T4789.28—2003中4.69。4.3液体硫乙醇酸盐培养基（FT)：GB/T4789.28—2003中4.70。4.4动力-硝酸盐培养基：GB/T4789.28--2003中4.72。4.5含铁牛奶培养基：GB/T4789.28-2003中4.71。4.6卵黄琼脂培养基：GB/T4789.28--2003中4.68。4.70.1%蛋白陈水：GB/T4789.28—2003中4.85。4.8硝酸盐还原试剂：GB/T4789.28--2003中3.17。4.9革兰氏染色液：GB/T4789.28—2003中2.25检验程序
产气英膜梭菌检验程序见图1。
GB/T4789.13—2003
镜检形态
6操作步骤
6.1活菌计数培养
稀释液
琼旗混
合领注
25g(mL)检样+225mL0.1%蛋白陈水剂均质、离心、稀释
稀群液
琼脂混
合倾注
稀释液
琼脂混
合傻注
稀释液
琼脂混
合倾注
厌氧培养，36℃±1℃、24h，熙色菌落计数任挑黑色菌落10个，分别接种FT培养基确证试验
硝酸盐还原
菌数计算
稀释液
琼脂混
合倾注
牛奶发酵
卵磷脂分解
6.1.1按无菌操作称取食品检样25g（mL）放人均质器中，加0.1%蛋白陈水225mL，低速搅动1min～2min，使之均质化，作为1：10稀释液。6.1.2以上述1：10稀释的均质液按1mL加0.1%蛋白陈水9mL做成10-2~10-的系列稀释液。6.1.3吸取各稀释液1ml.分别放人两个灭菌平皿内。每个平Ⅲ浇注约50℃的SPS琼脂15mL～20mL，仔细转动平扭，使稀释液和琼脂充分混匀。6.1.4上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内，于36℃士1℃培养24h。6.1.5选取长有30个～300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。92
6.2确证试验
GB/T4789.13—2003
6.2.1由平板上任取10个黑色菌落，分别按种FT培养基，于36℃士1℃培养18h～24h。6.2.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。6.2.3用接种环（针)穿刺接种动力-硝酸盐培养基，于36℃士1℃培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。然后，滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各0.5mL，观察硝酸盐是否被还原。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。6.2.4取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴烈发酵”现象，5h内不发酵者为阴性。产气英膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
6.2.5用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板（每张平板至少可接种10点），于36℃土1℃厌氧培养24 h，观察接种点的变化。产气英膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的混浊带。
6.3菌数计算
根据黑色菌落的计数（6.1.5）和确证试验的结果（6.2），计算每克（毫升）食品检样的含菌数例如：10稀释液的平板长有黑色菌落100个，而供做确证试验的10个菌落中有7个被确证为产气荚膜梭菌，则每克（毫升)食品检样所含产气英膜梭菌数为：100×0.7×104=7×10
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