【农业标准】 大豆品种纯度鉴定技术规程 SSR分子标记法

中华人民共和国农业行业标准

NY/T 1788—2009

大豆品种纯度鉴定技术规程
SSR分子标记法

Protocol of purity identification for soybean variety using—SSR molecular markers

中华人民共和国农业部 发布

前 言

本标准的附录A、附录B为资料性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。

本标准负责起草单位：全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所。

本标准主要起草人：廖琴、陈应志、邱丽娟、常汝镇、关荣霞、李春广、王爱珺。

大豆品种纯度鉴定技术规程 SSR分子标记法

1 范围

本标准规定了大豆品种纯度的SSR分子标记检测技术规程。

本标准适用于大豆品种纯度鉴定。

2 原理

简单重复序列(SSR)分布于大豆整个基因组的不同位置上,不同品种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，扩增产物通过电泳进行分离，经硝酸银染色，可辨别SSR电泳谱带。通过选用品种间具有广泛多态性的SSR引物,根据PCR扩增产物电泳谱带差异(等位变异数目),鉴定大豆品种纯度。

3 仪器设备、试剂与耗材

参见附录A。

4 试剂配制

4.1 DNA提取试剂

4.1.1 $0.5 \text{ mol/L}$乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(pH8.0)溶液

称取EDTA 186.1 g,倒入$1\,000\text{ mL}$烧杯中，加$800\text{ mL}$去离子水溶解，用固体氢氧化钠调pH至8.0，再加去离子水定容至$1\,000\text{ mL}$,混匀，过滤。在4℃条件下保存。

4.1.2 $1 \text{ mol/L}$三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)溶液(pH8.0)

称取 Tris 60.55 g,倒入$500\text{ mL}$烧杯中，加$400\text{ mL}$去离子水溶解，用 HCl调pH至8.0，再加去离子水定容至 $500\text{ mL}$,混匀，4℃条件下保存。

4.1.3 DNA提取液

称取氯化钠(NaCl) 14.6 g,倒入$500\text{ mL}$烧杯中，加 $100\text{ mL}$去离子水溶解，加$1 \text{ mol/L Tris-HCl}$溶液$50\text{ mL}$,加$0.5 \text{ mol/L EDTA}$溶液$50\text{ mL}$和 SDS 10 g,用去离子水定容至 $500\text{ mL}$,$60℃$水溶解，混匀。4℃条件下保存。

4.1.4 三氯甲烷/异戊醇(24+1)

取$240\text{ mL}$三氯甲烷和$10\text{ mL}$异戊醇，混匀。

4.2 PCR扩增试剂

4.2.1 四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs: dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液配制

取浓度为 $100 \text{ mmol/L}$的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各$20\text{ }\mu\text{L}$混合，加入$920\text{ }\mu\text{L}$超纯水，配成终浓度为 $2 \text{ mmol/L}$工作液。-20℃条件下保存。

4.2.2 引物稀释

用超纯水分别配制正向(F)引物和反向(R)引物至浓度均为$100\text{ }\mu\text{mol/L}$的储存液，取$10\text{ }\mu\text{L}$储存液加入 $490\text{ }\mu\text{L}$超纯水配成$2\text{ }\mu\text{mol/L}$工作液。

4.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂

4.3.1 $10\times \text{TBE}$缓冲液