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NY/T 2249—2012
菠萝枯萎病病原分子检测技术规范
Technical specification of molecular detection for pineapple mealybug wilt pathogen
中华人民共和国农业部 发 布
菠萝凋萎病病原分子检测技术规范
1 范围
本标准规定了菠萝凋萎病病原(包括菠萝调萎伴随病毒和菠萝杆状病毒)的分子检测方法。
本标准适用于菠萝种苗及大田植株中菠萝调萎伴随病毒和菠萝杆状病毒的定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
NY/T 2249—2012
SN/T 1193 基因检验实验室技术要求
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
菠萝调萎病病原 pathogen of pineapple mealybug wilt(PMW)包括菠萝调萎伴随病毒(Pineapple mealybug wilt-associated virus, PMWaV)和菠萝杆状病毒(Pineapple bacilliform virus, PBaV)。其中菠萝调萎伴随病毒包括菠萝调萎伴随病毒1号(PMWaV-1)、菠萝调萎伴随病毒2号(PMWaV-2)和菠萝调萎伴随病毒3号(PMWaV-3)。该病害病原的分类地位、寄主范围、危害症状及地理分布参见A.1~A.4。
3.2
热休克蛋白70 heat shock protein 70, HSP - 70分子量约为70 kD的一类热休克蛋白，是分子伴侣的主要成分，对蛋白的跨膜转运及特定构象的维持等起着重要作用，是进化序列保守的蛋白之一。
3.3
聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而互相结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。
3.4
逆转录聚合酶链式反应 reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCRRT-PCR是先利用依赖于RNA的DNA聚合酶，将待测RNA逆转录为DNA；再以逆转录后的一段DNA作为模板，以模板DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖于DNA的DNA聚合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性的技术扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段。
3.5
tRNAmet结合区tRNAmet是携带延长肽链上甲硫氨酸的tRNA，它负责识别延伸中AUG密码子。tRNAmet结合区
4 原理
根据 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 的 HSP-70 特有碱基序列设计特异性引物进行 RT-PCR 扩增，依据是否分别扩增获得预期的 $590\ \mathrm{bp}$、$611\ \mathrm{bp}$ 和 $499\ \mathrm{bp}$ 的 DNA 片段，判断样品中是否携带菠萝调萎伴随病毒；根据 PBcCoV 的 tRNAGly结合区特有碱基序列设计特异性引物进行 PCR 扩增，依据是否扩增获得预期 $973\ \mathrm{bp}$ 的 DNA 片段，判断样品中是否携带菠萝杆状病毒。
5 仪器设备、用具和试剂
按 B.1 和 B.2 的规定执行。
6 取样
以田间菠萝大苗植株或冠芽较嫩叶片或菠萝组培苗叶片作为检测样品，取样量为 $1.0\ \mathrm{g} \sim 5.0\ \mathrm{g}$；实验室检测用量为 $0.1\ \mathrm{g}$。
7 检测方法
7.1 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 的 RT-PCR 检测
7.1.1 检测样品总 RNA 提取
参照附录 B 的方法提取检测样品和对照样品的总 RNA，设蒸馏水作为空白对照，进行 RT-PCR 扩增。
7.1.2 引物序列
| 引物 | 引物序列 | 正反义 | 扩增片段长度 | 检测病毒 | |
|---|---|---|---|---|---|
| PMWaV-1 F | $5' \text{-GCTACAAACTTCAGCAATC-} 3'$ | 正义 | $590\ \mathrm{bp}$ | PMWaV-1 | |
| PMWaV-1 R | $5' \text{-ACAGGAAGGACAACACTTAC-} 3'$ | 反义 | |||
| PMWaV-2 F | $5' \text{-GCATCCACAATTTCCTAC-} 3'$ | 正义 | $611\ \mathrm{bp}$ | PMWaV-2 | |
| PMWaV-2 R | $5' \text{-ATAGAACTAGACTCATCGG-} 3'$ | 反义 | |||
| PMWaV-3 F | $5' \text{-CTTATGGAAAGGTTATCG-} 3'$ | 正义 | $499\ \mathrm{bp}$ | PMWaV-3 | |
| PMWaV-3 R | $5' \text{-AGTTTCCTTAGATTTGGGA-} 3'$ | 反义 | |||
7.1.3 RT-PCR 扩增反应
RT-PCR 反应体系：自棉花叶病毒 (AMV) 反转录酶反应缓冲液 $12.5\ \mu\mathrm{L}$，分别加入 $10\ \mu\mathrm{mol/L}$ 的引物 PMWaV-1 F、PMWaV-1 R、PMWaV-2 F、PMWaV-2 R 与 PMWaV-3 F、PMWaV-3 R 各 $1.5\ \mu\mathrm{L}$，RNA $1\ \mu\mathrm{L}$，AMV 反转录酶混合液 $1\ \mu\mathrm{L}$，加无 RNA 酶的超纯水至 $25\ \mu\mathrm{L}$。
RT-PCR 反应条件：$50^\circ\mathrm{C}$ 反转录 $30\ \mathrm{min}$；$94^\circ\mathrm{C}$ 反应 $2\ \mathrm{min}$ 灭活反转录酶，$94^\circ\mathrm{C}\ 30\ \mathrm{s}$，不同温度退火（检测 PMWaV-1 退火温度为 $60^\circ\mathrm{C}$，PMWaV-2 和 PMWaV-3 退火温度为 $55^\circ\mathrm{C}$）$1\ \mathrm{min}$，$72^\circ\mathrm{C}$ 延伸 $1\ \mathrm{min}$，30 个循环；最后 $72^\circ\mathrm{C}$ 延伸 $7\ \mathrm{min}$。取出 PCR 反应管，对反应产物进行电泳检测或 $4^\circ\mathrm{C}$ 条件下保存，存放时间不超过 $24\ \mathrm{h}$。
7.2 PBcCoV 的 PCR 检测
7.2.1 引物序列
PBcCoV-F: $5' \text{-AGAAAAGAGAATGAACAAC-} 3'$
PBcCoV-R: $5' \text{-AGTGATAAAGGGTCAAATAA-} 3'$
PCR 片段长度为 $973\ \mathrm{bp}$。
