【国家标准】 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞微核试验

中华人民共和国国家标准
GB15193.28—2020
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞微核试验
2020-09-11发布
2021-03-11实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
1范围
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞微核试验
本标准规定了体外哺乳类细胞微核试验的基本试验方法和技术要求本标准适用于评价受试物的遗传毒性作用。2术语和定义
2.1微核
GB15193.282020
细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍留在细胞质中的整条染色单体或染色体的无着丝断片或环。在末期单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成。2.2着丝粒
在细胞分裂期染色体与纺锤体纤维连接的区域，以使子染色体有序移动到子细胞两极、2.3非整倍体
二倍体染色体组中缺少或额外增加一条或若干条完整的染色体的变异类型2.4非整倍体诱变剂www.bzxz.net
作用于细胞有丝分裂或者减数分裂周期，导致细胞分裂异常，诱发非整倍体的物质。2.5染色体断裂
染色体臂出现长度大于染色体臂宽度的裂隙。2.6染色体断裂剂
引起染色体发生断裂的物质。
2.7细胞毒性
对细胞结构或功能的有害效应，最终可导致细胞死亡。试验目的和原理
体外哺乳类细胞微核试验是一种用于检测哺乳类细胞在受试物处理后是否产生微核的遗传毒性检测方法。本方法适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和诱发非整倍体的能力。如果3h~6h
短期处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无代谢活化系统的长期处理试验，相当于用受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期。1
4仪器和试剂
4.1仪器
细胞培养箱、倒置显微镜、正置显微镜、超净台、离心机。4.2培养液
GB15193.28—2020
根据细胞类型来选择适宜的培养基。对于V79、CHL或CHO细胞，常用MEM(Eagle)培养液加入10%胎牛血清和适量抗菌素（可用青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL)。对于L5178Y或TK6细胞常用RPMI1640培养液加入10%马血清和适量抗菌素（可用青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL）。4.3代谢活化系统
4.3.1S9辅助因子的配制
4.3.1.1镁钾溶液
氯化镁1.9g和氯化钾6.15g加蒸馅水溶解至100mL。2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)
4.3.1.20.2
磷酸氢二钠(Na2HPO4,28.4g/L)440mL磷酸二氢钠(NaH2PO4H2O,27.6g/L)60
mL,调pH
至7.4,0.103MPa20min灭菌或滤菌。4.3.1.3辅酶-Ⅱl（氧化型)溶液无菌条件下称取辅酶-II，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol溶液，现用现配。4.3.1.4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用蒸馏水溶解配制成0.05mol/L溶液，过滤灭菌。现用现配。4.3.2大鼠肝S9组分的诱导和配制选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g~200g，约5周龄6周龄。将多氯联苯(Aroclor1254)溶于玉米油中，浓度为200g/L，按500mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射，5d后处死动物，处死前禁食12h。
也可采用苯巴比妥钠和β-黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-茶黄酮，剂量均为80mg/kg体重，连续3d，禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加0.1mol/L氯化钾溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000r/min,1min～2min)或组织匀浆器（低于20000r/min，1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝匀浆在低温（0℃~4℃）高速离心机上以9000g离心10min，吸出上清液为S9组分，分装于无菌冷冻管中，每管2mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置-80℃低温保存。S9组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量(Lowry法），每毫升蛋白含量不超过40mg为宜，并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于-80℃低温或冰冻干燥，保存期不超过1年。2
4.3.3S9混合液的制备
GB15193.282020
S9混合液浓度一般为1%～10%，实际使用浓度可由各实验室决定，但需对其活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性。一般由S9组分和辅助因子按1：9组成10%的S9混合液，无菌现用现配。10%S9混合液10mL配制方法如下：取上述磷酸盐缓冲液6.0mL、镁钾溶液0.4mL、葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液1.OmL、辅酶-IⅡI溶液1.6mL、肝S9组分1.0mL，混匀，置冰浴中待用。4.4肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B(CytochalasinB,cytoB)溶液用二甲基亚砜(DMSO)配制适当浓度的储备液，避光冷藏保存。cytoB的终浓度通常为3μg/mL~6μg/mL，实验室应根据各种细胞系选择cytoB的适当终浓度，以达到理想的双核细胞出现频率。4.50.075mol/L氯化钾溶液
5.59g氯化钾加蒸馏水至1000mL。4.6固定液
甲醇：冰醋酸为3：1，临用前配制。4.7姬姆萨(Giemsa)染液
取姬姆萨染料3.8g，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375mL，待完全溶解后，再加125mL甘油，放入37℃温箱中保温48h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，2周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时，取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8)混合，配成其应用液，现配现用。磷酸盐缓冲液(1/15mol/L,pH6.8)配制方法如下：a)第一液：取磷酸氢二钠(Na2HPO)9.47g溶于1000mL去离子水中，配成1/15mol/L溶液：b）第二液：取磷酸二氢钾(KH2PO)9.07g溶于1000mL去离子水中，配成1/15mol/L溶液：c）取第一液50mL加于第二液50mL中混匀，即为pH6.8的1/15mol/L磷酸盐缓冲液。5试验方法
5.1受试物
固体受试物应溶解于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度使用。受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性5.2细胞
可选用中国仓鼠肺细胞株（V79、CHL)或卵巢细胞株（CHO)、小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)、人外周血淋巴细胞株（如TK6）和原代培养细胞。推荐使用CHL或L5178Y细胞株。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。5.3试验方案选择
试验分为使用和不使用cytoB两种方案。方案一：在细胞经过受试物处理，有丝分裂前使用cytoB,然后观察分析已完成一次有丝分裂的细胞（双核细胞）微核率。当选用人类淋巴细胞时，建议采用方案一，因为不同来源的细胞周期不同，而且不是所有的细胞都对植物血球凝集素(PHA）有反应。方案二：3
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不使用cytoB，细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率。如果有证据表明受试物干扰cytoB的活性，或cytoB可能影响细胞的生长（如小鼠淋巴瘤细胞株），建议采用方案二。5.4剂量
5.4.1剂量设置
至少应设置3个检测剂量。受试物没有细胞毒性时，从最高剂量往下设至少2个剂量，一般情况下间隔系数可为2～3：有细胞毒性时，其剂量范围应涵盖从55%土5%的细胞毒性到儿乎无细胞毒性5.4.2最高剂量的选择
决定最高剂量的因素是细胞毒性、受试物的溶解度以及pH、渗透压。受试物有细胞毒性时，最高剂量应能引起55%土5%的细胞毒性：如果没有细胞毒性或沉淀，最高剂量应是5μL/mL、5mg/mL或1Ommol/L。对溶解度较低的物质，当达到最大溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。
5.4.3细胞毒性的确定
在S9存在和不存在两种条件下依据细胞完整性和生长情况的指标来确定细胞毒性。方案一，使用cytoB，细胞毒性的确定可依据复制指数(Replication指数(Cytokinesis
ProliferationIndex,CBPI。
Index,RI)或胞质分裂阻断增殖
（双核细胞数+2×多核细胞数+）/500RI=
（双核细胞数，+2×多核细胞数。）/500式中：
500——细胞总数；
T受试物组；
C一一阴性对照组。
细胞毒性=100-RI
式中：
单核细胞数十2×双核细胞数+3×多核细胞数500
CBPI=1时等同于100%细胞生长抑制：500—一细胞总数。
细胞毒性=100-
式中：
T——受试物组；
C—阴性对照组。
CBPI-1
方案二，不使用cytoB,细胞毒性的确定可依据相对细胞增长数(RelativeIncreaseinCellCounts，RICC）或相对增殖倍数（RelativePopulationDoubling，RPD)。受试物组细胞数的增加（试验后一试验前）RICC=
阴性对照组细胞数的增加（试验后一试验前）细胞毒性=100-RICC
式中：
受试物组双倍数量
阴性对照组双倍数量
log（试验后细胞数/试验前细胞数）双倍数量三
细胞毒性=100-RPD
5.4.4阳性对照
GB15193.282020
阳性对照物包括染色体断裂剂和非整倍体剂。加S9时，断裂剂可以选用环磷酰胺和苯并(a）；不加S9时，断裂剂可以选用阿糖胞苷、丝裂霉素C、甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉；非整倍体剂只用于不加S9时，可以选用秋水仙素和长春新碱。如果短期处理试验方案在S9存在和不存在两种条件下都选用断裂剂作为阳性对照，那么长期处理试验方案应该选用非整倍体剂作为阳性对照。如果选用的细胞本身具有代谢能力，则不需要另外添加S9，阳性对照应该同时使用断裂剂和非整倍体剂。5.4.5阴性对照
溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶媒是培养液（不含血清）或水。使用水作为溶媒时其体积不应大于总体积的10%。DMSO也是常用溶媒，但终浓度不应大于1%。
5.4.6空白对照
如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照5.5试验步骤
5.5.1细胞准备
将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，以收获细胞时，培养皿（瓶）的细胞未长满为标准，贴壁细胞一般以长到85%左右为佳。
5.5.2受试物处理
5.5.2.1应用方案一，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗细胞，加入无血清培养液及一定浓度的受试物（需代谢活化者同时加入S9mix)，置于培养箱中3h~6h；结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞，加入含10%血清的新鲜培养液和cytoB，继续培养1.5个~2.0个正常细胞周期后收集细胞。对于淋巴细胞，最有效的方法是在有丝分裂原（如PHA）刺激后44h~48h开始受试物处理，这时细胞开始进入分裂周期。
如果3h~6h短期处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无S9的长期处理试验，用cytoB和受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期，在处理结束后收集细胞。如果已知或怀疑受试物（如核苷类物质）可能影响细胞周期（特别是P53活性细胞），则细胞收获时间应该再延长1.5个～2.0个正常细胞周期。5.5.2.2应用方案二，与5.5.2.1处理方法相同，只是不加cytoB。5.5.3收获细胞与制片
每次培养都应单独收获细胞和制片，如果细胞混合液的分散度良好则不需要进行低渗处理。5
5.5.31消化
GB15193.28—2020
贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以800r/min~10005r/min的速度离心5min，弃去上清液。悬浮细胞不需要消化，直接离心
5.5.3.2低渗
加入0.075mo1/L氯化钾溶液2mL，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37℃细胞培养箱中低渗处理1min~5min
5.5.3.3固定
加入2mL固定液，混匀后固定5min以上，以800r/min~1000清液。重复一次，弃去上清液。5.5.3.4滴片
加入数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥5.5.3.5染色
推荐用姬姆萨染色（5%～10%姬姆萨染液，15min~20吖啶橙或Hoechst33258)。
r/min的速度离心5min，弃去上
min),也可用DNA特异性荧光染料（如：如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交（FISH）或引物原位标记等方法。
5.5.4阅片
5.5.4.1微核的判断标准：微核一般为圆形或椭圆形：直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特征及折光性一致：与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。
5.5.4.2应用方案一，每个剂量组至少分析2000个双核细胞，计算微核细胞率（一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作一个含微核细胞）。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。对不规则的双核细胞（如两个核大小相差悬殊）和多于两个核的细胞不进行分析。
5.5.4.3应
应用方案二，每个剂量组至少分析2000个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。6数据处理和结果判定
6.1数据处理
数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与空白对照组、阴性对照组（溶媒对照组）、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法（如X检验)进行处理。
6.2结果判定
下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：a）受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关：GB15193.282020
b）受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。7
试验报告
7.1试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。7.2试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。7.3试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。7.4试验摘要。
7.5受试物：名称、鉴定资料、CAS号（如已知）、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。
7.6溶媒。
7.7细胞株：细胞株的来源、名称。7.8试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。7.8.1代谢活化系统：制备S9所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9混合液的配方。如S9是通过购买获得应注明生产单位和批号。7.8.2对照物：阳性对照物的名称、生产厂家、批号和选用浓度7.8.3培养液：所用培养液的名称、血清类别和使用浓度7.8.4接种的细胞密度以及所用培养血（瓶)的规格。7.8.5有无使用cytoB，如果使用，注明cytoB的浓度、作用时间。7.8.6处理时间：受试物与试验系统的接触时间。7.8.7制片方法。
7.8.8结果评价方法。
7.9结果。
试验结果应包括细胞毒性的测定、加受试物后的溶解情况及对pH和渗透压的影响（如果有影响）。
7.9.2试验结果：受试物各剂量组及各对照组的微核细胞率及统计结果。7.9.3本实验室的阳性对照组和阴性对照组（常用溶媒，如水、DMSO）微核细胞率历史范围（说明样品数）。
7.10试验结论：给出受试物在本试验条件下的体外微核试验的结论，必要时对有关问题进行讨论。试验的解释
阳性结果表明受试物在该试验条件下可引起所用哺乳类细胞染色体损伤，微核细胞率增加。阴性结果表明在该试验条件下受试物不引起所用哺乳类细胞染色体损伤。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。
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