【YY医药标准】 医疗器械免疫原性评价方法 第5部分:用M86抗体测定动物源性医疗器械中a-Gal抗原清除率

ICS11.120.20
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1465.5—2016
医疗器械免疫原性评价方法
第5部分：用M86抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率
Immunogenic evaluation method of medical devices-Part 5.Determination of a-Gal antigen clearance in medical devices utilizinganimal tissues and their derivatives with M86 antibody2016-07-29发布
国家食品药品监督管理总局
2017-06-01实施
YY/T1465《医疗器械免疫原性评价方法》，分为以下部分：一第1部分：体外T淋巴细胞转化试验；ELISA法；
一第2部分：血清免疫球蛋白和补体成分测定一第3部分：空班形成细胞测定琼脂固相法；一一第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验半体内法；一第5部分：用M86抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率。本部分为YY/T1465的第5部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，YY/T1465.5—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248）归口。本部分起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心，四川医疗器械生物材料和制品检验中心、军事医学科学院野战输血研究所、烟台正海生物技术有限公司。本部分起草人：孙晓霞、刘成虎、袁瞰、杨晓琴、高红伟、宫锋、陆美娇、张东刚。I
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α-Gal抗原是存在于哺乳动物（人类、猿类、简鼻猴除外）细胞膜上的糖蛋白和糖脂抗原。当人体接受含有一定量α-Gal抗原的动物源性医疗器械/材料时可能发生超急性免疫排斥反应及慢性免疫毒性反应。M86抗体是可以与天然或合成的糖蛋白和糖脂中α-Gal抗原结合的特异性单克隆抗体。基于M86抗体的特异性，可以对动物源性医疗器械/材料中α-Gal抗原进行评价。本部分使用M86抗体，通过比较处理前后待测样品中α-Gal抗原含量，计算α-Gal抗原的清除率，为动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除过程的有效性提供评价方法。本标准中的方法受试验样品处理过程中α-Gal抗原活性，M86抗体效价稳定性等因素影响。试验者宜根据试验样品的特性对方法的适用性进行确认。
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1范围
医疗器械免疫原性评价方法
第5部分：用M86抗体测定动物源性医疗器械中aα-Gal抗原清除率
YY/T1465.5—2016
YY/T1465的本部分给出了测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率的方法，适用于α-Gal抗原清除过程有效性的评价。bzxZ.net
本部分的方法适用于能通过研磨充分暴露α-Gal抗原的材料，如不能通过研磨充分暴露α-Gal抗原，可考虑采用其他经确认的适宜方法。注：附录A给出了免疫组织化学法评价方法的示例。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.2医疗器械生物学评价第2部分：动物福利要求（GB/T16886.2--2011，ISO10993-2.2006IDT)
GB/T16886.20E
医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则与方法(GB/T16886.20--2015.ISO/TS10993-20.2006,IDT)YY/T0771.1动物源医疗器械第1部分：风险管理应用（YY/T0771.1—2009，ISO22442-1：2007IDT
中国药典2010版
3术语和定义
GB/T16886.20和YY/T0771.1界定的术语和定义适用于本文件。4试验原理
将试验样品和过量特异性M86抗体共同孵育。分离剩余的M86抗体并将其与预先包被在固相载体上的过量α-Gal抗原结合，加底物显色。将最终显色结果与未经去α-Gal抗原处理的样品测定结果相比，即可得到试验样品中α-Gal抗原的清除率。5试剂和仪器
5.1试剂
5.1.1磷酸盐缓冲液（PBS），PH7.2~7.4。5.1.21%牛血清白蛋白（BSA）溶液：0.1gBSA溶于10mLPBS溶液中。1
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包被液（碳酸盐缓冲液，pH9.6）。5.1.3
5.1.4市售小鼠M86抗体。
5.1.5抗小鼠标记二抗。
5.1.6市售α-Gal-BSA。
5.2仪器和设备
酶标仪。
低温离心机。
震荡器。
高精度天平（0.0001g）。
试验步骤
6.1试验样品处理
样品处理方法宜确保α-Gal抗原充分暴露，同时避免其被过度破坏。推荐经处理后的样品粒径分布范围为(0μm～90μm）。附录B中给出了不同类型样品处理的实例。注1：动物源性生物材料以胶原纤维等结构蛋白为主要组成成分，试验者宜采用适宜的样品制备方法以确保试验样品中的a-Gal抗原充分暴露。
注2：每份样品设平行样3份，最终测定结桌取其平均值注3：可以根据委托方的要求，取不同批号或同一批号的样品3份，用以评价不同批次或同一批次内的工艺稳定性。
6.2试验系统对照品制备
6.2.1总则
考虑到本标准中的方法受多种因素的影响，试验前宜采用适当的对照品对试验体系的合理性进行验证，推荐使用小鼠骨髓瘤（SP2/O）细胞或免红细胞（RRBC）。如选用其他对照品，宜对其有效性进行确认。
6.2.2SP2/0细胞
SP2/0(ATCCCRL-1581TM）是由绵羊红细胞免疫的BALB/c小鼠的脾脏B细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，不分泌免疫球蛋白。用RPMI1640完全培养基培养至生长状态良好，调整细胞浓度至1×107个/mL备用。
6.2.3RRBC
6.2.3.1推荐使用未进行过试验的健康新西兰家兔，SPF级。如选用其他品系家免，宜对其适宜性进行说明。取血前应将动物至少饲养5d以适应实验室环境。所有的动物试验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行，并且还应符合GB/T16886.2的要求。6.2.3.2取新鲜家兔全血20mL，加人含玻璃珠的锥形瓶中振摇10min，除去纤维蛋白。加人0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇勾，2000r/min离心5min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成1×10°个/mL，4℃保存备用。
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6.2.4制备步骤
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用40μL1%BSA重悬1×10°个SP2/0细胞或RRBC，混匀后取20μL细胞倍比稀释，共4个浓度梯度（包括不含细胞的空白组）。分别向细胞原液及稀释液中加人1%BSA落液，80μL/管，则最高浓度组含细胞原液的体积比为20%，随着倍比稀释其余各组体积比呈梯度降低。每个浓度梯度3复孔备用。
6.3试验分组
试验分组包括：
a）未经α-Gal抗原去除过程的材料组；b）经α-Gal抗原去除过程的材料组；阴性对照组，不含α-Gal抗原的材料：c)
d）试验溶剂对照组。
6.4最佳M86抗体稀释度的测定
6.4.1总则
不同批次M86抗体的效价可能有一定的差异，宜确定每批次M86抗体的最佳稀释度。将购买的市售M86等分成适宜体积，贮存备用。6.4.2α-Gal抗原标准品制备
取α-Gal-BSA溶于pH9.6的包被液，加人微孔板中，100μL/孔，推荐的终浓度为1μg/mL～10μg/mL，4C条件下包被过夜，用1%BSA封闭后备用。6.4.3M86抗体最佳稀释度
在每个微孔板中分别加人100μL倍比稀释的M86抗体溶液，共8个稀释度，推荐初始稀释度为1：25，稀释度在1：25与1：3200之间。混勾，室温振荡孵育1.5h，用洗液洗板3次。加人HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育1h后，用洗液洗板3次。显色后，用酶标仪读取吸光度值，绘制吸光度值与对应M86稀释度的反应曲线。取反应曲线刚进人平台区稀释度的两倍浓度值作为最佳稀释度。每次使用前将贮存的M86抗体重新稀释。6.5M86抗体共孵育
在每个对照品和按6.3分组初始浓度相同的各试验管中分别加人160L6.4确定的稀释比例的M86抗体溶液，即每个反应管的总体积为200μL。混匀，4℃C震荡孵育过夜，离心管在10000g离心5min后取上清液备用。
6.6间接抑制ELISA法检测上清溶液中剩余M86抗体在96孔板的相应孔中加人过量的α-Gal抗原落液，100L/孔，4C孵育过夜，用洗液洗板3次。分别取按6.5制备的100μL上清液加人相应抗原包被的96孔板中，37C振荡孵育2h后，用洗液洗板3次。加人HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育1h后，用洗液洗板3次。显色后，用酶标仪读取吸光度值。
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数据分析
7.1首先对试验体系对照品和试验样品进行3次重复测定，取3次测定的平均吸光度值，按式（1)计算M86结合抑制率（剩余M86结合率）。%×100%
式中：
IM86结合抑制率：
（1）
-经α-Gal抗原去除过程的材料组、未经α-Gal抗原去除过程的材料组、阴性对照或试验体系a
对照品的OD值；
b溶剂对照的OD值。
7.2用试验体系对照品M86结合抑制率（3次重复测定）和相应稀释度获得结合抑制率曲线方程，R2宜不小于0.96。
7.3利用M86结合抑制率为纵坐标（y），组织勾浆浓度为横坐标（z）绘制曲线。根据曲线求出50%，结合抑制率对应各组样品浓度。按式(2)计算去除过程中α-Gal抗原的清除率：X100%
式中：
C—a-Gal抗原的清除率；
工——经α-Gal抗原去除过程的材料组50%结合抑制率对应的浓度；3y一一未经α-Gal抗原去除过程的材料组50%结合抑制率对应的浓度。8试验报告
试验报告中应至少包含下列信息：试验样品名称、规格型号和批号；a）i
b）样品制备方法：
c）试验体系对照品信息；
试验条件和试验步骤；
试验结果。
·（2）
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A.1试验原理
附录A
（资料性附录）
免疫组织化学法测定酶解猪皮产品中a-Gal抗原清除率示例YY/T1465.5—2016
将特异性M86抗体与试验样品中aα-Gal抗原结合并以免疫组织化学法进行染色，通过比较α-Ga抗原去除过程前后的显色程度，计算α-Gal抗原的清除率。A.2
试剂和仪器
中性福尔马林。
5%BSA。
3二甲苯。
小鼠M86抗体。
组织修复液。
乙醇。
烘箱。
组织切片器具。
光学显微镜。
实验程序
样品制备
取福尔马林保存固定的待测样品，常规石蜡包埋，切片，置60C烘箱中烘烤过夜备用。A.3.2
试验分组
按下列分组进行试验（每组5个样品，每个样品平行制备3张切片）：阴性对照组，推荐选用不含α-Gal抗原的组织，如人脱细胞真皮或GGTA1基因敲除猪皮。a
阳性对照组，未经α-Gal抗原去除过程的猪皮肤样品。e
试验样品组，解去除-Gal抗原的猪皮样品。A.3.3
试验步骤
A.3.3.1切片常规二甲苯脱蜡。梯度乙醇处理。5
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A.3.3.2蒸馏水冲洗，PBS浸泡，5min/次，共2次。A.3.3.3微波修复10min，先将修复液加热至95℃～100℃再放人切片。用3%过氧化氢在室温下孵育10min，阻断内源性过氧化物酶的活性。A.3.3.4
PBS冲洗，5min/次，共3次。
A.3.3.6用5%BSA溶液封闭30min。加人6.4确定的适宜稀释度的M86抗体，4C孵育过夜。A.3.3.7
用PBS冲洗切片，5min/次，共3次。按说明书操作要求加人二抗工作溶液，室温或37C孵育15min～20min。用PBS冲洗切片，A.3.3.9
5min/次，共3次。
A.3.3.10DAB显色显3min～15min。自来水充分冲洗。A.3.3.11
如需要可进行苏木精（0.5%～1%)复染细胞核，脱水，透明，封片。试验结果
图像分析软件进行免疫组化定量分析，将三组切片按照同一采集参数拍摄，每张切片随机采集高倍视野（400×）图像10张。根据显色结果选定参数进行分析计算，结果按表A.1记录。表A.1各组样品显色评分表
试验样品组
切片编号
记分平均值
（去除α-Gal抗原的
酶解猪皮）
阳性对照组
（未经a-Gal抗原
去除过程的猪皮）
阴性对照组
（人脱细胞真皮或
GGTA1基因敲除猪皮）
结果评价
按式(A.1)计算去除过程α-Gal抗原的清除率。I = (1
式中：
I——α-Gal抗原的清除率；
A一试验样品组记分平均值减去阴性对照组记分平均值；B—阳性对照组记分平均值减去阴性对照组记分平均值。YY/T1465.5—2016
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B.1总则
附录B
（资料性附录）
样品处理示例
样品处理宜确保α-Gal抗原的充分暴露，同时宜避免其被过度破坏。推荐使用组织匀质仪\进行样品处理，其他等效的处理方法也可使用，但使用者宜对所选择的试验参数进行确认。B.2样品处理
B.2.1骨质类样品
对于骨植人物类样品，取100mg样品于1.5mL研磨瓶中，加8粒3mm和1粒5mm陶瓷磁珠，转速为6800r/min，30s/次，液氮冷却研磨2次或更多次（间隔时间30s），至样品全部粉碎（粒径小于100μm），置于冰上备用。取适量试验样品，精确称重并记录，放人0.5mL离心管中，加人1%BSA溶液0.1mL。取勾浆液进行倍比梯度稀释，至少4个梯度。分别取40μL放在0.5mL离心管中备用。B.2.2干燥型样品
取适量试验样品，精确称重并记录，用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小，放进1.5mL研磨瓶中，加人1%BSA溶液300μL，加8粒3mm和1粒5mm陶瓷磁珠，转速为6800r/min，30s/次，液氮冷却研磨2次或更多次（间隔时间30s），至样品全部粉碎（粒径小于100μm），形成均匀组织匀浆。取匀浆液进行倍比梯度稀释，至少4个梯度，分别取40μL放在0.5mL离心管中备用。B.2.3湿润型样品
取适量试验样品，放于1.5mL无菌离心管内，真空干燥或37℃干燥箱辅助干燥。然后取试验样品（≤300μg），精确称重并记录，用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小，放进研磨瓶中，加人1%BSA溶液300μL，加8粒3mm和1粒5mm陶瓷磁珠，转速为6800/min，30s/次，液氮冷却研磨2次或更多次（间隔时间30s），至样品全部粉碎，形成均匀组织勾浆。取勾浆液进行倍比梯度稀释，至少4个梯度，分别取40μL放在0.5mL离心管中备用。1）BertinPrecellys24是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。8
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