【YY医药标准】 医疗器械生物学评价纳米材料:细菌内毒素试验

ICS11.040.30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1295—2015
医疗器械生物学评价
纳米材料：细菌内毒素试验
Biological evaluation of medical devicesNanomaterial:Endotoxin test
[ISO 2970l:201o,Nanotechnologies-Endotoxin test on nanomaterialsamples for in vitro systems-Limulus amebocyte lysate(LAL) test,MOD)2015-03-02发布
国家食品药品监督管理总局
2016-01-01实施
YY/T1295—2015
规范性引用文件
术语和定义
缩略语
试验前准备
供试品
供试品制备
试验方法
结果评价
试验报告
附录A（资料性附录）
附录B（资料性附录）
附录C（资料性附录）
附录D（资料性附录）
附录E（资料性附录）
参考文献
鲨试验潜在干扰的举例
凝胶法
终点光度法
动态法
本标准与国际标准章条编号对照一览表和技术性差异及原因一览表1618
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草YY/T1295—2015
本标准修改采用ISO29701：2010《纳米技术纳米材料样品体外细菌内毒素试验：试验》。本标准与ISO29701:2010相比，在结构上有调整，表E.1列出了本标准与ISO29701：2010的章条编号对照表。
本标准与ISO29701：2010相比存在技术差异，表E.2给出了相应技术差异及其原因请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准的归口单位为中国食品药品检定研究院本标准起草单位：中国食品药品检定研究院，本标准主要起草人：陈丹丹、徐丽明、黄清泉、邵安良、冯晓明、王春仁。I
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1范围
医疗器械生物学评价
纳米材料：细菌内毒素试验
本标准描述了应用鲨试验评价纳米材料，用于细胞的体外生物学试验系统YY/T1295—2015
本标准适用于能够被水性介质（例如：水、血清或反应介质）分散或浸提的纳米材料，使纳米材料与这种介质在37℃培养适当的时间本标准仅限于体外试验的样本，该方法也可适用于经非肠道途径进行动物给药的纳米材料。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注且期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.122005.IS010993-12:2002.IDT)
GB/T25915.1洁净室及相关受控环境第1部分：空气洁净度等级（GB/T25915.1一2010，ISO14644-1：1999.IDT)
GB/T25915.2洁净室及相关受控环境第2部分：证明连续符合GB/T25915.1的检测与监测技术条件（GB/T25915.2—2010，ISO14644-2：2000.IDT）GB/T25915.7洁净室及相关受控环境第7部分：隔离装置（洁净风罩、手套箱、隔离器、微环境）（GB/T25915.7—2010.ISO14644-72004.IDT）中华人民共和国药典（三部）2010年版ISO10993-12：2007医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（Biologicalevaluation of medical devicesPart 12: Sample preparation and reference materials)3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
凝固蛋白原
coagulogen
鲨试剂中在内毒素引起的凝胶形成中起主要作用的凝固蛋白。注：凝固蛋白原由175个氨基酸组成，相对分子质量为19723。3.2
凝固蛋白
coagulin
鲨试剂中的凝固酶原激活物将凝固蛋白原转化为凝固蛋白。注：凝固蛋白由N末端片段多肽（Alal-Arg18）和C末端片段多肽（Gly47-Phe175）组成。3.3
内毒素endotoxin
革兰氏阴性菌细胞壁外膜的一种成分。1
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YY/T1295—2015
注：主要的活性部分是脂多糖（LPS)。3.4
内毒素单位
endotoxin unit;EU
内毒素活性标准单位。
注1：内毒素单位由WHO的ECBS在1996年作出定义，即0.1ngWHO参考标准内毒素（来源于埃希氏大肠杆菌0113:HK10:K(-))或10EU/ng。
注2：EU相当于内毒素的国际单位（IU)。3.5
灵敏度
sensitivity
凝胶法中鲨试剂的标示灵敏度或浊度法和显色基质法标准曲线的最低灵敏度注：单位为EU/mL：
鲨试剂
limulus amebocyte lysate
美洲或东方鲨的血细胞中提取的水状物3.7
鲨试验
limulus amebocyte lysate test细菌内毒素的检查法。
注：鲨试验在药典中称为细菌内毒素试验3.8
optical density:OD
光密度
特定波长下光物质的吸光度。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BET：细菌内毒素试验（bacterialendotoxintest)CSE：对照标准内毒素（controlstandardendotoxin）ECBS：生物标准化专家委员会（expertcommitteeonbiologicalstandardization）EF：无细菌内毒素（endotoxin-free）EU：细菌内毒素单位（endotoxinunit）I/EC：抑制/增强对照（inhibition/enhancementcontrol)LAL：鲨试剂(Limulusamebocytelysate)LPS：脂多糖（lipopolysaccharide）OD：光密度（opticaldensity）RSE：参考标准内毒素（referencestandardendotoxin）WHO：世界卫生组织（Worldhealthorganization）5试验前准备
纳米材料的贮存
纳米材料由于表面积大可以吸附环境中的很多污染物（包括内毒素）。因此，纳米材料使用前应贮存在无细菌内毒素的可密封的容器里（如玻璃容器）。2
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注1：塑料制品如聚丙烯宜避免用于贮存纳米材料，因为可能对鲨试验产生干扰（见附录A）。注2：无内毒素的氧化物粉末可以通过热处理获得5.2贴存容器
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用于贮存纳米材料和供试品的玻璃容器和其他对热稳定的容器宜在250℃至少加热30min或者180℃至少3h，或者650℃，1min。也可以使用市售的无菌无内毒素的聚苯乙烯容器。5.3纳米材料的处理
室内环境中的尘埃含有大量的内毒素，取样和操作过程中要避免尘埃与纳米材料的接触。实验室的空气应清洁（见7.5）。
6供试品
6.1分散液
能够分散在水溶液中的纳米材料可以直接或用无内毒素水稀释后用于鲨试验。6.2浸提液
纳米材料经无内毒素反应介质，生理盐水或其他浸提介质浸提后用于鲨试验7供试品制备
7.1分散方法
分散过程可以经过下列一个或多个步骤：一手工研磨；
一机械研磨；
超声。
分散介质依据体外试验的目的和特点而定注：纳米材料有大的表面积，多孔性、疏水性和其他特性使这一步骤变得困难。因此，分散方法需发展提高。7.2浸提方法
浸提条件，比如浸提介质，浸提时间，浸提温度和供试品的浓度可以参照相关体外试验的浸提条件没有pH指示剂（如苯酚红）的反应介质或缓冲盐溶液是更适合的浸提介质，以避免颜色的干扰。浸提介质应被证实是无内毒素的或是由无内毒素的试剂配制而成的。浸提介质中添加抗生素和抗真菌药可有效地防止细菌和真菌的生长。要证实添加的抗生素对鲨试验有无干扰（参见8.3.3）。浸提后浸提物应该离心后除去颗粒，应将上清液用无内毒素吸头收集到无内毒素试管或容器中作为鲨试验的样品。浸提条件包括离心都应被证实和记录。特别是离心条件应根据涉及的纳米材料确定。注1：推荐使用0.05%的聚山梨醇酯20作为来自玻璃纤维过滤器的可在空气中传播的内毒素浸提介质注2：0.1%的维生素E表面活性剂（维生素Ed-α生育酚聚乙烯glycol-1000琥珀酸盐）可以提高来自碳纳米物质中的内毒素的浸出量
注3：更多浸提方法的资料参见GB/T16886.12及ISO10993-12:2007。7.3浓度
必要时，供试品应加无内毒素水至体外细胞试验中确定的最高浓度。3
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供试品的贮存
供试品制备后尽快使用，因为贮存时可能发生内毒素含量下降或细菌量增长的情况。供试品应被贮存在无内毒素的可密封容器内（见5.2），温度在2℃～8℃。如果供试品贮存超过24h，应证实该贮存条件下样品的稳定性和均一性。实验室环境
7.5.1水和空气清洁度
室内环境中的水和尘埃通常含有大量的内毒素。纳米材料应使用无内毒素介质和无内毒素器血以保证无菌样品制备。实验室环境中应使用一个清洁的房间，一个清洁的空气罩或者一个同等的洁净度为ISO5级（百级）的空气净化装置（GB/T25915.1）。空气净化指南见GB/T25915.1GB/T25915.2和GB/T25915.7。
7.5.2器材和实验室器皿
用于制备供试品的器材和实验室器Ⅲ应该在250℃以上至少干热30min或者180℃至少3h，或者650℃1min以除去内毒素。不适合加热的，对热不稳定的材料应使用其他除内毒素方法。材料用强碱或氧化液浸泡后用无内毒素水清洗是一个可信的除去内毒素的方法。如果使用强碱或氧化液，方法需要被证实以确保除去内毒素，并且没有可能干扰试验的残余物留存。关于对热不稳定的实验室器皿如容器、试管、吸头等无内毒素塑料制品可从商业渠道购买7.5.3冲洗用水
水是器材和器血中检测到内毒素的来源之一。实验室器材和器血去除内毒素处理后可用蒸留水冲洗。蒸馏已被证实可除去污染水中的内毒素，但制备蒸留水时有可能由于不合适的设备和不准确的操作方式导致内毒素污染。在室内制备的蒸留水应该定期测量内毒素水平以确保水中仅含有极低水平的内毒素。如果蒸馏水中的内毒素污染是无法避免的，就应该使用市售的无内毒素水。8试验方法
8.1原理
内毒素激活鲨试剂中的一个因子并引发蛋白级联反应。其中一个活化因子将凝固酶原激活为凝固酶，凝固酶催化鲨试剂中的凝固蛋白原转化为凝固蛋白，并通过二硫键自然地被此结合，形成鲨试剂的混浊并最终形成凝胶。判断凝胶形成主要通过倒置试管用眼睛去观察。这个方法不需要光度计就能完成这些步骤。使用市售试剂的凝胶法其最灵敏的测定值是0.015EU/mL。注：凝胶法描述在附录B。
8.2可替代的试验方法
8.2.1终点法
经过一定的反应时间测量反应混合物的光密度。与终点光密度有关的方法有两种：浊度法和测量对硝基苯胺（p-nitroaniline，p-NA)的显色基质法。由于灵敏度低和技术上要在一个指定时间点固定浊度有困难，这种简单的终点浊度法被动态浊度法取代，见8.2.2。至少有两种方法检测反应混合物中的p-NA：
直接在405nm波长检测p-NA的光密度；4
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-在540nm和550nm之间的波长检测p-NA的重氮基品红衍生物YY/T1295—2015
市售的终点光密度法的试剂在405nm波长检测OD的检测限是0.01EU/mL，重氮显色法的检测限是0.001EU/mL。
注：终点光度法描述在附录C。
8.2.2动态法
通过光度仪测定反应混合物的显色速率或浊度达到预定OD的时间。由于是动态的方法，在反应过程中的多个时间点都能读出从合成肽释放的力-NA的OD值或反应混合物的浊度的OD值，因此有几种类型的自动化计算工具得到发展。为了用动态法更加精确和准确地测量内毒素，可以使用精密的自动化检测仪器。使用商业上销售的自动化工具进行动态法，最高检测限可达到0.001EU/mL。8.3试验方法的选择和确认
8.3.1最低检测限或最低灵敏度
在体外试验中产生生物学反应的内毒素临界浓度是依据使用的体外试验系统而变化的。0.01ng/mL内毒素引起人的巨噬细胞释放IL-13和TNF-α，而0.048ng内毒素引起人树突状细胞或外周血单核细胞的生物学反应不明显。最好是知道体外试验系统容许污染的内毒素水平，以选择合适的鲨试验。鲨试剂的灵敏度应高于或至少等于容许的相关体外试验的内毒素污染水平。8.3.2由供试品引起的潜在的抑制或增强作用8.3.2.1已报道有几种材料会干扰鲨试验。新近合成的一些纳米材料由于他们的特性，还不清楚对鲨试验有无潜在的抑制或增强作用。注：附录A给出潜在的干扰的举例。8.3.2.2在使用终点法或动态法时供试品的颜色或浊度有可能引起干扰。应依据供试品的光学特性选择试验方法。
8.3.3试验方法的确认
8.3.3.1纳米材料对内毒素试验的干扰作用可以通过对已知或未知内毒素量的供试品的系列稀释进行验证。
注1：试验方法见附录B、附录C和附录D注2：试验方法的验证要求见《中华人民共和国药典（三部）\（2010版）附录ⅡE。8.3.3.2鲨试剂反应的最佳pH在6～8之间。当试验被抑制时应测量试验样品和鲨试剂组成的反应混合物的pH值。如果应调整pH,要调整试验样品的pH使反应混合物的pH在上述最佳pH范围内。注1：调整pH时，可使用无内毒素的TRIS缓冲液.0.1mol/L的氢氧化钠溶液或0.1mol/L的盐酸溶液：注2：调整pH引人的盐类可能会干扰鲨试剂的反应（见附录A）。8.4试验步骤
细菌内毒素试验的试验方法可使用欧洲、日本或美国药典的方法。使用东方鲨试剂时的试验方法见《中华人民共和国药典（三部）》2010年版，附录斑E。9结果评价
9.1概论
当评价纳来材料的鲨试验检测结果时，应科学地评价，了解试验有局限性。仔细考虑纳来材料对鲨5
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试验的干扰性质是非常重要的。在这些情况中，应对干扰作用的可接受限值进行讨论并对结果进行说明。
9.2试验应用指南
9.2.1如果通过供试品的稀释或其他方法不能成功地克服干扰，那么这种供试品就不能用于鲨试验9.2.2当内毒素的污染是不可避免的时候，可以使用试剂，如多粘菌素B处理供试品以排除内毒素的影响。
9.2.3当有可能存在β-1，3葡聚糖的污染时，应使用不会与β-1，3葡聚糖反应的内毒素特异性鲨试剂例如血清可能被来自酵母菌、真菌或其他细菌的β-1，3葡聚糖污染，而普通的鲨试剂不仅和内毒素发生反应还会和β-1,3葡聚糖发生反应。因此，必要时应推荐使用不含β-1,3葡聚糖的血清制备供试品。10
试验报告
10.1试验报告应与试验步骤一致。10.2试验报告应包括下列内容：a)
试验结果；
试验步骤；
试验过的纳米材料的完整信息确认；供试品制备的步骤，供试品的贮存条件和试验室环境分级的信息；鲨试剂信息确认（产品名称、制造商分类或规格、生产批号或日期、灵敏度等）；内毒素标准品信息确认（名称分类或规格、生产批号或日期、效价等）：试验的有效性包括供试品的干扰试验抑制作用
附录A
（资料性附录）
鲨试验潜在干扰的举例
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盐类：醋酸钠溶液（CH.COONa，0.3mol/L），碳酸氢钠溶液（NaHCO0.1mol/L），氯化钾溶液(KCl,50mmol/L)，氯化钠溶液（NaCl0.6mol/L）注：可逆的：供试品稀释可消除抑制。A.1.2
肝素。
注：可逆的（添加Na+和Ca+消除抑制）。一种无内毒素的商业用的阳离子缓冲剂，可用于消除抑制。3金属离子：Fe2+，Fe3+，Cr3+，A13+。A.1.3
注：不可逆的：添加乙二胺四乙酸-钠盐从而恢复其部分活性。A.1.4
塑料（聚丙烯）。
利用功能性颗粒季铵。
粒子过滤器：纤维素酯。
蛋白酶抑制剂。
聚山梨醇20。
注：可逆的：供试品稀释消除抑制。A.2
增强作用
乙二胺四乙酸-4-钠盐。
注1：机理还没有阐明。
注2：高浓度的乙二胺四乙酸-钠盐能够抑制鲨试剂反应，这是由于其与试验反应所需的二价阳离子形成螯合物，但是，在反应混合物中添加0.5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠盐或三钠盐即可观察到无干扰（抑制作用或增强作用)的鲨试验。
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B.1概述
附录E
（资料性附录）
凝胶法
本附录描述了一个利用鲨试剂进行凝胶法的示例。B.2试剂免费标准下载网bzxz
B.2.1用于凝胶法的标示灵敏度入的鲨试剂。B.2.2无内毒素的水（EF-水）。B.2.3冻干的内毒素工作标准品（CSE）。注：冻干的鲨试剂可以从商业途径获得。B.3
利用无内毒素的玻璃器血或者无内毒素的聚苯乙烯试管或器血制备内毒素标准系列稀释液注1：使用准备好的无内毒素的仪器和试验室器血，见7.5.2注2：通常无内毒素的制品被贴上标签为无热原B.3.2试管架。
移液管、带有吸管端的自动移液器或者带有塑料针筒的重复使用移液器应无内毒素。不循环式水浴锅或者干式培养箱[控制温度为（37士1)℃]。B.3.4
漩涡混合器。
计时器。
标准内毒素溶液的制备
原液的制备
应使用对照标准内毒素的冻干粉。玻璃瓶内含有的对照标准内毒素应该用EF-水重新溶解制成原液。由标准品所附证书上的值决定。B.4.2
系列标准液的制备
系列标准液利用EF-水稀释CSE溶液进行制备。系列标准液的浓度应包含0.25入，0.5入，1.0入和2.0入四个浓度。当原液被稀释成任何浓度时，为了降低吸量误差，稀释倍数都应该不超过10。B.5抑制作用或增强作用对照制备（I/EC)应利用未稀释的供试品稀释CSE溶液制备I/EC。1/EC的浓度应包含0.25入0.5入，1.0入和2.0入四个浓度。为了避免供试品的过度稀释，CSE溶液的稀释液的量应不超过5%（如在I/EC总量为1mL时，CSE溶液稀释液的量应总共不超过50uL）。8
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