【国家标准】 食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定

中华人民共和国国家标准
GB5009.121—2016
食品安全国家标准
食品中脱氢乙酸的测定
2016-08-31发布
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
本标准代替GB/T5009.121—2003《食品中脱氢乙酸的测定》。本标准与GB/T5009.121—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定”；
-增加液相色谱法；
——液相色谱法采用GB/T23377—2009的方法；一增加试样分类；
改进气相色谱法中样品的制备和提取方法；修改气相色谱法的色谱条件。
GB5009.121—2016
1范围
食品安全国家标准
食品中脱氢乙酸的测定
GB5009.121—2016
本标准规定了果蔬汁、果蔬浆、酱菜、发酵豆制品、黄油、面包、糕点、烘烤食品馅料、复合调味料、预制肉制品及熟肉制品中脱氢乙酸含量的测定方法。本标准适用于果蔬汁、果蔬浆、酱菜、发酵豆制品、黄油、面包、糕点、烘烤食品馅料、复合调味料、预制肉制品及熟肉制品中脱氢乙酸含量的测定，其他食品可参考执行。气相色谱法
第一法
2原理
固体（半固体）样品，沉降蛋白、经脱脂酸化后，用乙酸乙酯提取；果蔬汁、果蔬浆样品经酸化后，用乙酸乙酯提取：用配氢火焰离子化检测器的气相色谱仪分离测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水3.1试剂
3.1.1乙酸乙酯（C,H.O2)：色谱纯。3.1.2正己烷（C,H1）：色谱纯。3.1.3盐酸(HCI)。
3.1.4硫酸锌（ZnSO,·7H,O)。
氢氧化钠(NaOH)。
3.2试剂配制
盐酸溶液（1+1，体积比）：量取50mL盐酸加人到50mL水中。3.2.1
3.2.2硫酸锌溶液（120g/L）：称取12g硫酸锌，溶于水并稀释至100mL。3.2.3氢氧化钠溶液（20g/L）：称取2g氢氧化钠.溶于水并稀释至100mL。3标准品
脱氢乙酸（DehydroaceticAcid.C.H.O，，CAS：520-45-6）标准品：纯度≥99.5%。3.4标准溶液的制备
3.4.1脱氢乙酸标准贮备液（1.0mg/mL）：准确称取脱氢乙酸标准品0.1000g（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容。4℃保存，有效期为3个月，1
GB5009.121—2016
3.4.2脱氢乙酸标准工作液：分别精确吸取脱氢乙酸标准贮备液0.01mL、0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释并定容，配制成浓度为1.00μg/mL、10.0uμg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200ug/mL标准工作液。4℃保存，有效期为1个月。4仪器和设备
4.1气相色谱仪，配氢火焰离子化检测器。天平：感量为0.1mg和1mg。
离心机：转速≥4000r/min。
超声波清洗器：功率35kW。
粉碎机。
不锈钢高速均质器。
4.7 pH计。
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1果蔬汁果蔬浆：称取样品2g~5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加10mL水振摇1min，加1mL盐酸溶液（3.2.1）酸化后，准确加人5.0mL乙酸乙酯，振摇提取2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定
5.1.2酱菜、发酵豆制品：样品用不锈钢高速均质器均质。称取样品2g~5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加人约15mL水、2.5mL硫酸锌溶液（3.2.2）.用氢氧化钠溶液（3.2.3）调pH至7.5超声提取15min，转移至25mL容量瓶中，加水定容。样液移人离心管中，4000r/min离心10min取10mL上清液.加1mL盐酸溶液（3.2.1）酸化后.准确加人5.0mL乙酸乙酯.振摇2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定
5.1.3面包、糕点、烘烤食品馅料、复合调味料、预制肉制品及熟肉制品：样品用粉碎机粉碎或不锈钢高速均质器均质。称取样品2g~5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加人约15mL水、2.5mL硫酸锌溶液（3.2.2），用氢氧化钠溶液（3.2.3）调pH至7.5，超声提取15min，转移至25mL容量瓶中，加水定容。样液移人分液漏斗中，加人5mL正已烧，振摇1min，静置分层，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取10mL上清液，加1mL盐酸溶液（3.2.1)酸化后，准确加人5.0mL乙酸乙酯.振摇2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定。5.1.4黄油：称取样品2g~5g（精确至0.001g）.置于50mL离心管中，加入约15mL水、2.5mL硫酸锌溶液（3.2.2），用氢氧化钠溶液（3.2.3）调pH至7.5，超声提取15min，转移至25mL容量瓶中，加水定容。样液移人分液漏斗中，加入5mL正已烷，振摇1min，静置分层，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取10mL上清液，加1mL盐酸溶液（3.2.1）酸化后，准确加人5.0mL乙酸乙酯，振摇2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定。5.21
仪器参考条件
5.2.1毛细管柱：极性毛细柱（化学键和聚乙二醇固定相，30mX0.32mm×0.25μm），或相当者。5.2.2柱温升温程序：初温150℃，以10℃/min速率升至210℃，20℃/min速率升至240℃，保持2 min。
5.2.3进样口温度：240℃。
5.2.4检测器温度：300℃。
5.2.5载气（Nz）流量：1.0mL/min。5.2.6分流进样，分流比为5：1，进样体积1.0μL。5.3标准曲线的制作
GB5009.121—2016
将脱氢乙酸标准工作液（3.4.2）分别注入气相色谱仪中，测定相应峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。（脱氢乙酸标准色谱图见附录A）。5.4测定
将测定溶液注入气相色谱仪中，以保留时间定性，同时记录峰面积，根据标准曲线得到测定溶液中的脱氢乙酸浓度。
5.5空白试验
除不加试样外，空白试验应与样品测定平行进行，并采用相同的分析步骤分析。6分析结果的表述
果蔬汁、果蔬浆试样中脱氢乙酸含量按式（1）计算Xi
(ci-ca)×V×1000
mX1000X1000
其他试样中脱氢乙酸含量按式（2)计算：X，
式中：
（ci-c）×Vi×V×1000
mXVX1000x1000
-试样中脱氢乙酸的含量，单位为克每千克（g/kg）；X
试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；空白试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；乙酸乙酯定容体积，单位为毫升（mL）；称取试样的质量，单位为克（g）；试样中脱氢乙酸的含量，单位为克每千克（g/kg）；试样处理后定容体积，单位为毫升（mL）；萃取脱氢乙酸所取试样液体积，单位为毫升（mL）。.（1
.（2)
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
果蔬汁、果蔬浆取样量5g，确定检出限为0.0003g/kg，定量限为0.001g/kg；其他试样取样量5g样液定容体积25mL，取10mL样液提取，确定检出限为0.001g/kg，定量限为0.003g/kg3
9原理
第二法液相色谱法
GB5009.121—2016
用氢氧化钠溶液提取试样中的脱氢乙酸，经脱脂、去蛋白处理，过膜，用配紫外或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。10
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水10.1试剂
甲醇(CH,O)：色谱纯
乙酸铵（CH.O,N）：优级纯。
氢氧化钠（NaOH)。
正已烷（C,Hu）。
甲酸(CH.O.)。
硫酸锌（ZnSO4·7H,O)。
试剂配制
乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵.溶于水并稀释至1L。氢氧化钠溶液（20g/L）：称取20g氢氧化钠，溶于水并稀释至1L甲酸溶液（10%）：量取10mL甲酸.加水90mL，混匀硫酸锌溶液（120g/L）：称取120g硫酸锌.溶于水并稀释至1L甲醇溶液（70%）：量取70mL甲醇，加水30mL，混匀。10.3标准品
脱氢乙酸（DehydroaceticAcid,CH.O4，CAS：520-45-6）标准品：纯度≥99.5%。10.4标准溶液的制备
10.4.1脱氢乙酸标准备液（1.0mg/mL）：准确称取脱氢乙酸标准品0.1000g（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，用10mL氢氧化钠溶液（10.2.2）溶解，用水定容。4℃保存，有效期为3个月。2脱氢乙酸标准工作液：分别吸取脱氢乙酸贮备液0.1mL、1.0mL5.0mL、10mL、20mL于100mL10.4.2
容量瓶中，用水定容。配制成浓度为1.00μg/mL、10.0μgmL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/ml标准工作液。4℃保存，有效期为1个月。仪器和设备
高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。分析天平：感量为0.1mg和1mg。11.2
11.3粉碎机。
11.4不锈钢高速均质器。bZxz.net
11.5超声波清洗器：功率35kW。11.6
涡旋混合器。
离心机：转速≥4000r/min。
11.8pH计。
GB5009.121—2016
11.9Ci：固相萃取柱：500mg，6mL（使用前用5mL甲醇、10mL水活化，使柱子保持湿润状态）。分析步骤
12.1试样制备与提取
12.1.1果蔬汁、果蔬浆：称取样品2g~5g（精确至0.001g）.置于50mL离心管中，加人约10mL水用氢氧化钠溶液（10.2.2）调pH至7.5，转移至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，4000r/min离心10min。取20mL上清液用10%的甲酸溶液（10.2.3）调pH至5，定容到25mL。取5mL过已活化固相萃取柱.用5mL水淋洗，2mL70%的甲醇溶液（10.2.5）洗脱，收集洗脱液2mL，涡旋混合，过0.45um有机滤膜，供高效液相色谱测定。12.1.2酱菜、发酵豆制品：样品用不锈钢高速均质器均质。称取样品2g~5g（精确至0.001g），置于25mL离心管中，加约10mL水、5mL硫酸锌溶液（10.2.4），用氢氧化钠溶液（10.2.2）调pH至7.5，转移至25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。置于25mL离心管中，超声提取10min，4000r/min离心10min，取上清液过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。12.1.3面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料：样品用粉碎机粉碎或不锈钢高速均质器均质。称取样品2g～5g（精确至0.001g），置于25mL离心管（如需过固相萃取柱则用50mL离心管）中，加入约10mL水5mL硫酸锌溶液（10.2.4），用氢氧化钠溶液（10.2.2）调pH至7.5，转移至25mL容量瓶（如需过固相萃取柱则用50mL容量瓶）中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10min，转移到分液漏斗中，加人10mL正已烷，振摇1min，静置分层，弃去正已烷层，加人10ml.正已烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取上清液过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。若高效液相色谱分离效果不理想，取20mL上清液，用10%的甲酸（10.2.3）调pH至5.定容到25mL，取5mL过已活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，2mL70%的甲醇溶液（10.2.5）洗脱，收集洗脱液2mL.涡旋混合，过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。12.1.4黄油：称取样品2g~5g（精确至0.001g）置于25mL离心管（如需过固相萃取柱则用50mL离心管）中，加人约10mL水、5mL硫酸锌溶液（10.2.4），用氢氧化钠溶液（10.2.2）调pH至7.5，转移至25mL容量瓶（如需过固相萃取柱则用50mL容量瓶）中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10min，转移到分液漏斗中，加人10mL正已烷，振摇1min，静置分层，弃去正已烷层，加人10mL正已烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取上清液过0.45um有机滤膜.供高效液相色谱测定。若高效液相色谱分离效果不理想，取20mL上清液，用10%的甲酸（10.2.3）调pH至5，定容到25mL，取5mL过已活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，2mL70%的甲醇溶液（10.2.5）洗脱，收集洗脱液2mL，涡旋混合，过0.45um有机滤膜，供高效液相色谱测定，12.2仪器参考条件
色谱柱：Cls柱，5μm，250mm×4.6mm（内径）或相当者12.2.1
12.2.2流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵（10+90.体积比）。12.2.3
流速：1.0mL/min。
12.2.4柱温：30℃。
进样量：10μL。
检测波长：293nm。
12.3定性分析
GB 5009.121—2016
依据保留时间一致性进行定性识别的方法，根据脱氢乙酸标准样品的保留时间，确定样品中脱氢乙酸的色谱峰（参见附录B）。必要时应采用其他方法进一步定性确证。12.4标准曲线的制作
将脱氢乙酸标准工作液（10.4.2)分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。12.5测定
将测定溶液注入液相色谱仪中，测得相应峰面积，根据标准曲线得到测定溶液中的脱氢乙酸浓度12.6空白试验
除不加试样外，空白试验应与样品测定平行进行，并采用相同的分析步骤分析。3分析结果的表述
试样中脱氢乙酸含量按式（3）计算：e-c)xVx1000xf
m×1000×1000
式中：
X——试样中脱氢乙酸的含量，单位为克每千克（g/kg)；试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；co
空白试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；试样溶液总体积，单位为毫升（mL）；过固相萃取柱换算系数（f=0.5）；f
称取试样的质量，单位为克（g）。（3)
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5其他
以样品取样量5g，确定方法的检出限为0.002g/kg，定量限为0.005g/kg。6
附录A
脱氢乙酸气相色谱图
脱氢乙酸标准样品的气相色谱图见图A.1。75
脱氢乙酸标准样品的气相色谱图7
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附录B
脱氢乙酸液相色谱图
脱氢乙酸标准样品的液相色谱图见图B.1。0. 123
脱氢乙酸标准样品的液相色谱图GB5009.121—2016
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