【行业标准】 禽支原体PCR检测方法

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T553—2015
代替NY/T553—2002
禽支原体PCR检测方法
Detection of avian mycoplasmasby polymerase chain reaction(PCR)2015-05-21发布
2015-08-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照CB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替NY/T553—2002离支原体病诊断技术》。NY/T 553—2015
本标准与NY/T553—2002相比，删除了l消凝集实验，选取了PCR方法检测鸡毒支源体和滑液支原体，
本标推由中华人民共和国农业部提出。本标准巾全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归几：本标准起草单技：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：下娟、李卫华、土玉东、黄秀梅、龚振华,郭福牛。本标准的历欲版本发布情况为：-NY/T 553.-. 2002.
1范围
离支原体PCR检测方法
本标准规定了禽支原体PCR(聚合酶链式反应)的检测技术要求。本标适用于离支原体病的流行病学调查和辅助性诊断。2缩略语
下列缩略语适用于本义件。
MG：mycnpleasmugallisepticum鸡毒支原体，Ms:mycoplasmasynnuiae滑液案支原体。PES：phosphatebuffered xoturion磷酸盐缓冲液。3实验室设备要求
3.1仪器
NY/T 553--2015
基因序列分析仪、台式高速冷冻离心机，电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像系统、微量移液器、水欲锅.涡旋仪等。
3.2操作区域
样品处理区要有相应的生物安全设施：配液区要求高度洁净：电泳区要与其他操作区域相互隔离。3.3操作者
操作者成接受过PCR技术培训，熟悉防止核酸污染和溴乙锭污染的具体措施：熟悉电泳结果的判断方法。
4相关试剂
4. 1 2XTaq Master Mix
生物试剂公司牛产。
4.21.5%琼脂糖凝胶
4.31×TAF缓冲液
4.4溴乙锭（10μg/μL）
见A3。
4.5商品化的DNA分子量标准
要求在100 bp~-300 bp之间有5条以的指示条带，4.6标准菌株
S6株、WVU1853株购自中国兽医药品监察所。4.7阴性对照品
用高压火菌的PBS作为阴性对照标准品。5操作程序
5.1样品处理
NY/T553—2015
将气管拭了、关节愛穿刺液、关节面拭了样品慰浮于1 m PI鸡溶液中,混旬成悬浮液；气臂、肺、气囊等组织器官充分研磨后，加入适量的I溶液，制成混悬液，备用；也对用分离培养后的菌液作为样品5.2DNA提取
将制成的悬浮液或悬液2. (00r/mifl离心5min.将离心后的上清或分离培养后的菌液置于1.5mL带益的微量离心管中，在4℃条件下，14.0006离心30min。用微量加样器仔细除去上清液，并将沉淀悬浮丁2双蒸水，将宵离心管中的内容物席水费沸10min，然后冰浴1c min：100离心10min上清液为DNA模板:川+护增H16 SrDNA，5.3引物
5.3.1MG引物序列
MG-JIF:5'-GAG CTA ATC TGT AAA GTI GGT C-3';MG -13R: 5'-GCT TCC TTG CGG TTA GCA AC - 3.5.3.2MS引物序列
MS-F:5 GAG AAG CAA AAT AGT GAT ATC A- 3 ;MS R:5' CAG ICG TCT CCG AAG TTA ACA A- 3.5.4PCR反应体系
2uI.PCR反应体系包括：
DNA模板
2XTaly Master Mix
七，下游引物混合物
每次试验应设阳性对照和阴性对照。先94℃变性5min.然底按94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸60s的顺序循环，共循坏35次：最后在72（温度下延伸10min，于4℃保存，备用5.5PCR产物电泳
PCR反应结束后，每个PCR管中加人5uL.加样缓冲液充分混勾，再每管取5μL加人琼脂糖凝胶板的加样孔，在位了凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5V/cm电压，电泳20Iin~40min（每次电泳时，每隔10min观察1次。当加样缓冲液中漠酚蓝电泳过平至凝胶下2/5处时.可停止电泳）。电泳后.置于紫外凝胶成像仪下观察，用分子量标准判断PCR扩增产物大小，6结果判定
阳性对照出现相应人小的扩增条带，且阴性对照无此扩增带时.判定检测有效；否则判楚检测结果无效，不能进行判断。
MG的PCR产物为185bp。如果在阳性对照出现185bp扩增带，阴性刘照无带出现(引物二聚体除外)时，试验成立，被检样品出现185bp扩增带为MG附性，否则为阴性。MS的PCR产物为207bp。如果在阳性对照出现207bp扩增带，阴性对照无带出现（引物二聚体除外)时，试验成，被检样品出现2C7bp扩增带为MS阳性，否则为阴性，2
A.11.5%琼脂糖凝胶的配制
0.5×TAE电冰缓冲液加至
附录A
【规范性附录】
相关试剂的配制
NY/T553—2015
微波炉巾完全融化，待冷至50℃~60℃时，加人之锭（EB)溶液5uL，操勺，倒人电泳板上，凝周所取下梳子，备用。
A.21XTAE缓冲液的配制
A. 2. 1配制 0. 5 mol/ L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 )溶液(pH 8. 0)水乙胺四乙酸一钠(EDIA-Na·2H())灭菌双蒸水
氢氧化钠调 PH 至
火菌双蒸水加至
用于配制A.2.2中的50×TAE
A.2.2配制50XTAF电泳缓冲液
羟基中基氨基i烷(Tris）
冰乙酸
0.5 mol/I乙二胺四乙酸二钠溶液(pI8. 0)灭菌双蒸水加至
用于配制 A2. 3 中的 1X TAE。A.2.3配制1XTAE缓冲液
50XTAE电泳缓冲液
灭菌双蒸水加至
溴乙锭（10μ)的配制
溴乙锭
灭菌双蒸水至
A.410×加样缓冲液
聚蔗糖
灭菌双蒸水
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甲莱青
100 mL
57. 1 ml.
1 000 ml.
1000 mL
10℃ mL
NY/T 553—2015
PRS溶液的配制如下：
Na: HPO. : 12H.0
双蒸馏水加至
附录B
（规范性附录）
PES溶液的配制
PCR产物大小对照见图C.1。
附录C
(规范性附录）
PCR产物大小对照
PCR产物大小对照
500 bp
400 bp
100 bp
NY/T553—2015
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