【国家标准】 食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验

中华人民共和国国家标准
GB4789.11-2014
食品安全国家标准
食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验2014-12-01发布
中华人民共和国
国家门生和计划生育委员会
2015-05-01实施
本标准代替GB/T4789.11-2003《食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验》本标准与GB/T4789.11-2003相比，主要变化如下：修改了标准名称；
修改了范围：
增加了术语和定义；
-修改了设备与材料；
修改了培养基与试剂
-删除了以无菌生理盐水稀释样品的步骤和杆菌肽敏感试验；增加了触酶试验；
增加了附录A。
GB4789.11—2014
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验本标准规定了食品中β型溶血性链球菌（Streptococcus）的检验方法。本标准适用于食品中β型溶血性链球菌的检验。2术语和定义
2.1β型溶血
在菌落周围形成完全透明的溶血环，红细胞完全溶解。2.2β型溶血性链球菌
GB 4789.11—2014
能够产生β型溶血的化脓（或A群）链球菌（Streptococcuspyogenes）和无乳（或B群）链球菌(Streptococcusagalactiae)。
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)
恒温培养箱：36℃±1℃；
冰箱：2℃~5℃；
厌氧培养装置：
天平：感量0.1g；
均质器与配套均质袋；
显微镜：10倍～100倍：
无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头：无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL：无菌培养皿：直径90mm：
pH计或pH比色管或精密pH试纸；水浴装置：36℃±1℃；
微生物生化鉴定系统。
4培养基和试剂
4.1改良胰蛋白陈大豆肉汤（Modifiedtryptonesoybeanbroth，mTSB）：见附录A中A.1。4.2哥伦比亚CNA血琼脂(ColumbiaCNAbloodagar)：见附录A中A.2。4.3哥伦比亚血琼脂(Columbiabloodagar)：见附录A中A.3。4.4革兰氏染色液：见附录A中A.4。4.5胰蛋白陈大豆肉汤（Tryptonesoybeanbroth,TSB）：见附录A中A.5。4.6草酸钾血浆：见附录A中A.6。1
4.70.25%氯化钙(CaCI)溶液：见附录A中A.7。4.83%过氧化氢(H202)溶液：见附录A中A.8。4.9生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。5检验程序
溶血性链球菌检验程序见图1
样品25g（或mL）+225mLmTSB
36℃±1℃
18h~24h
划线接种哥伦比亚CNA血琼脂平板36℃±1℃
18h~24h，厌氧培养
挑取可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB36℃±1℃
18h~24h
革兰氏染色镜检/触酶试验
确定鉴定
链激酶试验 (选做项目）
图1溶血性链球菌检验程序
6操作步骤
6.1样品处理及增菌
生化鉴定
GB4789.11—2014
按无菌操作称取检样25g（mL），加入盛有225mLmTSB的均质袋中，用拍击式均质器均质1min~2min：或加入盛有225mLmTSB的均质杯中，以8000r/min10000r/min均质1min2min。若样品为液态，振荡均匀即可。36℃±1℃培养18h～24h。6.2分离
将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板，36℃土1℃厌氧培养18h～24h，观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2mm～3mm，灰白色、半透2
明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血。6.3鉴定
6.3.1分纯培养
GB4789.11—2014
挑取5个（如小于5个则全选）可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃培养18h~24h。
6.3.2革兰氏染色镜检
挑取可疑菌落染色镜检。β型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，常排列成短链状6.3.3触酶试验免费标准下载网bzxz
挑取可疑菌落于洁净的载玻片上，滴加适量3%过氧化氢溶液，立即产生气泡者为阳性。β型溶血性链球菌触酶为阴性。
6.3.4链激酶试验（选做项目）
吸取草酸钾血浆0.2mL于0.8mL灭菌生理盐水中混匀，再加入经36℃±1℃培养18h～24h的可疑菌的TSB培养液0.5mL及0.25%氯化钙溶液0.25mL，振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动）。继续36℃±1℃培养24h，凝固块重新完全溶解为阳性，不溶解为阴性，β型溶血性链球菌为阳性。6.3.5其他检验
使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定7结果与报告
综合以上试验结果，报告每25g（mL）检样中检出或未检出溶血性链球菌。附录A
培养基与试剂
A.1改良胰蛋白陈大豆肉汤培养基（Modifiedtryptonesoybeanbroth，mTSB）A.1.1基础培养基（胰蛋白陈大豆肉汤TSB）A.1.1.1成分
胰蛋白陈
大豆蛋白陈
氯化钠
磷酸二氢钾（无水）
葡萄糖
蒸馏水
A.1.1.2制法
GB 4789. 11—2014
将A.1.1.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃灭菌15min，备用。A.1.2抗生素溶液
A.1.2.1多黏菌素溶液
称取10mg多黏菌素B于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。萘啶酮酸钠溶液
称取10mg萘啶酮酸于10mL0.05mol/L氢氧化钠溶液中，振摇混匀,充分溶解后过滤除菌。A.1.3完全培养基
A.1.3.1成分
胰蛋白陈大豆肉汤(TSB)
多黏菌素溶液
萘啶酮酸钠溶液
A.1.3.2制法
无菌条件下，将A.1.3.1中各成分进行混合，充分混匀，分装备用。A.2哥伦比亚CNA血琼脂（ColumbiaCNAbloodagar）A.2.1成分
胰酪蛋白陈
动物组织蛋白消化液
酵母提取物
牛肉提取物
A.2.2制法
玉米淀粉
氯化钠
多黏菌素
萘啶酸
蒸馏水
GB4789.11—2014
将A.2.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃灭菌12min，待冷却至50℃左右时加50mL：无菌脱纤维绵羊血，摇匀后倒平板。A.3哥伦比亚血琼脂（Columbiabloodagar）A.3.1基础培养基
A.3.1.1成分
动物组织酶解物
氯化钠
蒸馏水
A.3.1.2制法
8.0g~18.0g
将基础培养基成分溶解于蒸馏水中，加热促其溶解。121℃高压灭菌15min。2无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。
A.3.3完全培养基
A.3.3.1组分
基础培养基
无菌脱纤维绵羊血
A.3.3.2制法
当基础培养基的温度为45℃左右时，无菌加入绵羊血，混匀。校正pH至7.2土0.2。倾注15mL于无菌平血中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4h，或在4℃冷藏不得超过7d。A.4革兰氏染色液
A.4.1结晶紫染色液基础培养基
A.4.1.1成分
A.4.1.2制法
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.4.2革兰氏碘液
A.4.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.4.2.2制法
GB 4789.11—2014
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.4.3沙黄复染液
A.4.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.4.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.4.4染色操作步骤
将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗：滴加革兰氏碘液，作用1min水洗；滴加95%乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加复染液，复染1min，水洗后进行干燥，镜检。胰蛋白陈大豆肉汤（Tryptonesoybeanbroth，TSB）A.5
A.5.1成分
胰蛋白陈
大豆蛋白陈
氯化钠
磷酸二氢钾（无水）
葡萄糖
蒸馏水
A.5.2制法
将A.5.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3+0.2，121℃灭菌15min，分装备用。6
草酸钾血浆
A.6.1成分
A.6.2制法
草酸钾
GB4789.11—2014
草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾血浆。
0.25%氯化钙（CaC12)溶液
氯化钙（无水）
蒸馏水
A.7.2制法
称取22.2g氯化钙（无水）溶于蒸馏水中，分装备用。3%过氧化氢（H202)溶液
A.8.1成分
30%过氧化氢(H202)溶液
蒸馏水
吸取100mL30%过氧化氢(H202)溶液，溶于蒸馏水中，混匀，分装备用。7
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