【国家标准】 食品微生物学检验 商业无菌检验

中华人民共和国国家标准
GB4789.262013
食品安全国家标准
食品微生物学检验商业无菌检验2013-11-29发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2014-06-01实施
GB4789.26—2013
本标准代替GB/T4789.26一2003《食品卫生微生物学检验罐头食品商业无菌的检验》。
本标准与GB/T4789.26-2003相比主要变化如下：修改了标准的名称；
修改了范围；
删除了规范性引用文件；
-删除了术语和定义；
修改了设备和材料；
修改了培养基和试剂；
-增加了检验程序图：
修改了检验步骤；
修改了结果判定；
-修改了附录A和附录B。
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验商业无菌检验本标准规定了食品商业无菌检验的基本要求、操作程序和结果判定本标准适用于食品商业无菌的检验2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1低酸性罐藏食品lowacid cannedfoodGB4789.26—2013
除酒精饮料以外，凡杀菌后平衡pH大于4.6，水分活度大于0.85的罐藏食品，原来是低酸性的水果、蔬菜或蔬菜制品，为加热杀菌的需要而加酸降低pH的，属于酸化的低酸性罐藏食品。2.2酸性罐藏食品acidcannedfood杀菌后平衡pH等于或小于4.6的罐藏食品。pH小于4.7的番茄、梨和菠萝以及由其制成的汁以及pH小于4.9的无花果均属于酸性罐藏食品。设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱：2℃~5℃；
恒温培养箱：30℃±1℃；36℃±1℃；55℃±1℃；恒温水浴箱：55℃土1℃；
均质器及无菌均质袋、均质杯或乳钵；电位pH计（精确度pH0.05单位）显微镜：10倍～100倍：
开罐器和罐头打孔器：
电子秤或台式天平：
超净工作台或百级洁净实验室。4培养基和试剂
4.1无菌生理盐水：见附录A中A.1。结晶紫染色液：见附录A中A.2。4.2
二甲苯。
4.4含4%碘的乙醇溶液：4g碘溶于100mL的70%乙醇溶液1
5检验程序
商业无菌检验程序见图1。
36℃±1℃，10d保温，发
现膨胀立即剔出，开启检查
开启包装物
pH测定
感官检查
涂片染色镜检
符合商业无菌
6操作步骤
6.1样品准备
2℃～5
冰箱保藏
不符合商业无菌
GB4789.26—2013
留样，至少30mL（g）置
灭菌容器，2℃~5℃保藏
异常原因分析（选做项目）
商业无菌检验程序
去除表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况。6.2称重
1kg及以下的包装物精确到1g，1kg以上的包装物精确到2g，10kg以上的包装物精确到10g，2
并记录。
6.3保温
GB4789.26—2013
6.3.1每个批次取1个样品置2℃～5℃冰箱保存作为对照，将其余样品在36℃土1℃下保温10d。保温过程中应每天检查，如有膨胀或泄漏现象，应立即剔出，开启检查。6.3.2保温结束时，再次称重并记录，比较保温前后样品重量有无变化。如有变轻，表明样品发生泄漏。将所有包装物置于室温直至开启检查。6.4开启
6.4.1如有膨胀的样品，则将样品先置于2℃～5℃冰箱内冷藏数小时后开启。6.4.2如有膨用冷水和洗涤剂清洗待检样品的光滑面。水冲洗后用无菌毛巾擦干。以含4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完。膨胀样品以及采用易燃包装材料包装的样品不能灼烧，以含4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛市擦干。
6.4.3在超净工作台或百级洁净实验室中开启。带汤汁的样品开启前应适当振摇。使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用。如样品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处。立即在开口上方嗅闻气味，并记录。
注：严重膨胀样品可能会发生爆炸，喷出有毒物。可以采取在胀样品上盖一条灭菌毛巾或者用一个无菌漏斗倒扣在样品上等预防措施来防止这类危险的发生。6.5留样
开启后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少30mL（g）至灭菌容器内，保存2℃～5℃冰箱中，在需要时可用于进一步试验，待该批样品得出检验结论后可弃去。开启后的样品可进行适当的保存，以备日后容器检查时使用。6.6感官检查
在光线充足、空气清洁无异味的检验室中，将样品内容物倾入白色糖瓷盘内，对产品的组织、形态、色泽和气味等进行观察和嗅闻，按压食品检查产品性状，鉴别食品有无腐败变质的迹象，同时观察包装容器内部和外部的情况，并记录6.7pH测定
6.7.1样品处理
6.7.1.1液态制品混匀备用，有固相和液相的制品则取混匀的液相部分备用。6.7.1.2对于稠厚或平稠厚制品以及难以从中分出汁液的制品（如：糖浆、果酱、果冻、油脂等），取一部分样品在均质器或研钵中研磨，如果研磨后的样品仍太稠厚，加入等量的无菌蒸馏水，混匀备用。
6.7.2测定
6.7.2.1将电极插入被测试样液中，并将pH计的温度校正器调节到被测液的温度。如果仪器没有温度校正系统，被测试样液的温度应调到20℃土2℃的范围之内，采用适合于所用pH计的步骤进行测定。当读数稳定后，从仪器的标度上直接读出pH，精确到pH0.05单位。6.7.2.2同一个制备试样至少进行两次测定。两次测定结果之差应不超过0.1pH单位。取两次测定3
的算术平均值作为结果，报告精确到0.05pH单位。6.7.3分析结果
GB4789.26—2013
与同批中冷藏保存对照样品相比，比较是否有显著差异。pH相差0.5及以上判为显著差异。6.8涂片染色镜检
6.8.1涂片
取样品内容物进行涂片。带汤汁的样品可用接种环挑取汤汁涂于载玻片上，固态食品可直接涂片或用少量灭菌生理盐水稀释后涂片，待干后用火焰固定。油脂性食品涂片自然干燥并火焰固定后，用二甲苯流洗，自然干燥。
6.8.2染色镜检
对6.8.1中涂片用结晶紫染色液进行单染色，干燥后镜检，至少观察5个视野，记录菌体的形态特征以及每个视野的菌数。与同批冷藏保存对照样品相比，判断是否有明显的微生物增殖现象。菌数有百倍或百倍以上的增长则判为明显增殖7结果判定
样品经保温试验未出现泄漏：保温后开启，经感官检验、pH测定、涂片镜检，确证无微生物增殖现象，则可报告该样品为商业无菌。样品经保温试验出现泄漏：保温后开启，经感官检验、pH测定、涂片镜检，确证有微生物增殖现象，则可报告该样品为非商业无菌。若需核查样品出现膨胀、pH或感官异常、微生物增殖等原因，可取样品内容物的留样按照附录B进行接种培养并报告。若需判定样品包装容器是否出现泄漏，可取开启后的样品按照附录B进行密封性检查并报告。
无菌生理盐水
A.1.1成分
氯化钠
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
培养基和试剂Www.bzxZ.net
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.2
结晶紫染色液
A.2.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵溶液
将1.0g结晶紫完全溶解于95%乙醇中，再与1%草酸铵溶液混合。A.2.3染色法
将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。GB4789.26—2013
B.1培养基和试剂
溴甲酚紫葡萄糖肉汤
B.1.1.1成分
蛋白陈
牛肉浸膏
葡萄糖
氯化钠
溴甲酚紫
蒸馏水
B.1.1.2制法
附录 B
异常原因分析（选做项目）
0.04g（或1.6%乙醇溶液2.0mL）1000.0mL
GB 4789.26—2013
将除溴甲酚紫外的各成分加热搅拌溶解，校正pH至7.0土0.2，加入溴甲酚紫，分装于带有小倒管的试管中，每管10mL，121℃高压灭菌10min。B.1.2
疱肉培养基
B.1.2.1成分
牛肉浸液
蛋白陈
酵母膏
葡萄糖
磷酸二氢钠
可溶性淀粉
碎肉渣
B.1.2.2制法
B.1.2.2.1称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉500g，加蒸馏水1000mL和1moL/L氢氧化钠溶液25.0mL，搅拌煮沸15min，充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤，加水补足至1000mL，即为牛肉浸液。加入B.1.2.1除碎肉渣外的各种成分，校正pH至7.8土0.2B.1.2.2.2碎肉渣经水洗后晾至半干，分装15mm×150mm试管约2cm~3cm高，每管加入还原铁粉0.1g~0.2g或铁屑少许。将B.1.2.2.1配制的液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1cm。上面覆盖溶化的凡士林或液体石蜡0.3cm~0.4cm。121℃灭菌15min。B.1.3营养琼脂
B.1.3.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
B.1.3.2制法
15.0g~20.0g
GB4789.26—2013
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2~7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶或13mm×130mm试管，121℃高压灭菌15min。B.1.4酸性肉汤
B.1.4.1成分
多价蛋白陈
酵母浸膏
葡萄糖
磷酸二氢钾
蒸馏水
B.1.4.2制法
将B.1.4.1中各成分加热搅拌溶解，校正pH至5.0土0.2，121℃高压灭菌15min。B.1.5
麦芽浸膏汤
B.1.5.1成分
麦芽浸膏
蒸馏水
B.1.5.2制法
将麦芽浸膏在蒸馏水中充分溶解，滤纸过滤，校正pH至4.7士0.2，分装，121℃灭菌15min。5沙氏葡萄糖琼脂
B.1.6.1成分
蛋白陈
葡萄糖
蒸馏水
B.1.6.2制法
将各成分在蒸留水中溶解，加热煮沸，分装在烧瓶中，校正pH至5.6土0.2，121℃高压灭菌15min。B.1.7肝小牛肉琼脂
B.1.7.1成分
肝浸膏
小牛肉浸膏
际蛋白陈
新蛋白陈
胰蛋白陈
葡萄糖
可溶性淀粉
等离子酪蛋白
氯化钠
硝酸钠
蒸馏水
B.1.7.2制法
在蒸馏水中将各成分混合。校正pH至7.3土0.2，121℃灭菌15min。革兰氏染色液
结晶紫染色液
B.1.8.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
B.1.8.1.2制法
将1.0g结晶紫完全溶解于95%乙醇中，再与1%草酸铵溶液混合。B.1.8.2
革兰氏碘液
B.1.8.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
B.1.8.2.2制法
GB4789.26—2013
将1.0g碘与2.0g碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mLB.1.8.3
沙黄复染液
B.1.8.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
B. 1.8. 3.2
将0.25g沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。B.1.8.4染色法
B.1.8.4.1涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。B.1.8.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。GB4789.26—2013
B.1.8.4.3滴加95%乙醇脱色约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。B.1.8.4.4滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检，B.2低酸性罐藏食品的接种培养（pH大于4.6）B.2.1对低酸性罐藏食品，每份样品接种4管预先加热到100℃并迅速冷却到室温的疱肉培养基内；同时接种4管溴甲酚紫葡萄糖肉汤。每管接种1mL（g）~2mL（g）样品（液体样品为1mL～2mL固体为1g～2g，两者皆有时，应各取一半）。培养条件见表B.1。表B.1低酸性罐藏食品（pH>4.6）接种的疱肉培养基和溴甲酚紫葡萄糖肉汤培养基
疱肉培养基
疱肉培养基
溴甲酚紫葡萄糖肉汤
溴甲酚紫葡萄糖肉汤
培养温度
培养时间
96~120
96~120
B.2.2经过表B.1规定的培养条件培养后，记录每管有无微生物生长。如果没有微生物生长，则记录后弃去。
B.2.3如果有微生物生长，以接种环沾取液体涂片，革兰氏染色镜检。如在溴甲酚紫葡萄糖肉汤管中观察到不同的微生物形态或单一的球菌、真菌形态，则记录并弃去。在厄肉培养基中未发现杆菌，培养物内含有球菌、酵母、霉菌或其混合物，则记录并弃去。将漠甲酚紫葡萄糖肉汤和厄肉培养基中出现生长的其他各阳性管分别划线接种2块肝小牛肉琼脂或营养琼脂平板，一块平板作需氧培养，另一平板作厌氧培养。培养程序见图B.1。B.2.4挑取需氧培养中单个菌落，接种于营养琼脂小斜面，用于后续的革兰氏染色镜检；挑取厌氧培养中的单个菌落涂片，革兰氏染色镜检。挑取需氧和厌氧培养中的单个菌落，接种于厄肉培养基，进行纯培养。
B.2.5挑取营养琼脂小斜面和厌氧培养的疱肉培养基中的培养物涂片镜检。B.2.6挑取纯培养中的需氧培养物接种肝小牛肉琼脂或营养琼脂平板，进行厌氧培养；挑取纯培养中的厌氧培养物接种肝小牛肉琼脂或营养琼脂平板，进行需氧培养。以鉴别是否为兼性厌氧菌。B.2.7如果需检测梭状芽胞杆菌的肉毒毒素，挑取典型菌落接种肉培养基作纯培养。36℃培养5d，按照GB/T4789.12进行肉毒毒素检验。B.3酸性罐藏食品的接种培养（pH小于或等于4.6）B.3.1每份样品接种4管酸性肉汤和2管麦芽浸膏汤。每管接种1mL（g）~2mL（g）样品（液体样品为1mL～2mL，固体为1g～2g，两者皆有时，应各取一半）。培养条件见表B.2。9
表B.2酸性罐藏食品（pH≤4.6）接种的酸性肉汤和麦芽浸言汤培养基
酸性肉汤
酸性肉汤
麦芽浸膏汤
培养温度
GB4789.26—2013
培养时间
B.3.2经过表B.2中规定的培养条件培养后，记录每管有无微生物生长。如果没有微生物生长，则记录后弃去。
B.3.3对有微生物生长的培养管，取培养后的内容物的直接涂片，革兰氏染色镜检，记录观察到的微生物。
B.3.4如果在30℃C培养条件下在酸性肉汤或麦芽浸膏汤中有微生物生长，将各阳性管分别接种2块营养琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板，一块作需氧培养，另一块作庆厌氧培养。B.3.5如果在55℃培养条件下，酸性肉汤中有微生物生长，将各阳性管分别接种2块营养琼脂平板一块作需氧培养，另一块作厌氧培养。对有微生物生长的平板进行染色涂片镜检，并报告镜检所见微生物型别。培养程序见图B.2
B.3.6挑取30℃需氧培养的营养琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板中的单个菌落，接种营养琼脂小斜面，用于后续的革兰氏染色镜检。同时接种酸性肉汤或麦芽浸膏汤进行纯培养。挑取30℃厌氧培养的营养琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板中的单个菌落，接种酸性肉汤或麦芽浸膏汤进行纯培养
挑取55℃需氧培养的营养琼脂平板中的单个菌落，接种营养琼脂小斜面，用于后续的革兰氏染色镜检。同时接种酸性肉汤进行纯培养。挑取55℃厌氧培养的营养琼脂平板中的单个菌落，接种酸性肉汤进行纯培养。B.3.7挑取营养琼脂小斜面中的培养物涂片镜检。挑取30℃厌氧培养的酸性肉汤或麦芽浸膏汤培养物和55℃厌氧培养的酸性肉汤培养物涂片镜检。B.3.8将30℃需氧培养的纯培养物接种于营养琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板中进行厌氧培养，将30℃厌氧培养的纯培养物接种于营养琼脂或沙氏葡葡糖琼脂平板中进行需氧培养，将55℃需氧培养的纯培养物接种于营养琼脂中进行厌氧培养，将55℃厌氧培养的纯培养物接种于营养琼脂中进行需氧培养，以鉴别是否为兼性厌氧菌。
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