【国家标准】 派琴虫病诊断操作规程

ICS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 26618—2011
派琴虫病诊断操作规程
Protocol of diaguosis for Perkinsosis2011-06-16发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-11-01实施
本标准的附录 A 为规范性附录,附录 B 和附录 C 为资料性附录 本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。GB/T26618—2011
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院,福建出入境检验检疫局、黄岛出人境检验检疫局.国家海洋环境监测中心深圳出人境检验检疫局、上海出人境检验检疫局。本标准主要越草人吴绍强、林祥梅,刘建,郑腾、李西峰.粱玉波,刘，李建、韩雪清,贾广乐，梅琳。GB/T26618--2011
旅琴虫病是影响世界贝类养殖业发展的主要寄生虫病，为国际兽医局（OIE)规定的必报水生动物疫病之。本病1946年首次报道，当时，引起美国路易斯安那州的墨西哥海湾的大批牡蛎（Crassostreairginica)死亡。运今为止，已发现派琴虫存在于美洲、欧洲，澳洲、亚洲和非洲五大洲的许多贝类体内，包括牡蛎、鲍鱼、蛤子、扇贝，珍珠牡蛎,鸟蛤和始贝等体内，并在许多地区造成了严重的危害，死:率高送95。
1997年，我国在栉孔扇贝、虾夷扇贝、皱纹盘鲍，菲律宴蛤仔体内检测到派琴虫。美国2005年也从中国广西北海进口牡蛎中检出派琴虫。自前，派琴虫已经成为影响我国贝类养殖业发展的主病原之一。据对黄海北部三个海域的非律宾始的派琴虫感染状说进行调查的结果表明，除3月份和6月份的感染率分别为 95%和 90%之外,其他月份感染率均为100%。自前，派琴虫感染的诊断通常依靠OIE推荐的组织切片法,FTM组织培养法以及PCR方法。组织学方法可以通过显微镜下真接规察虫体或观察组织损伤来监测感染的分布情说。FTM培养派琴虫休眠抱了的方法是将派琴虫滋养体进行培养，培养后，虫体体积增大细胞壁增厚，而且不殖，是-种传统有效的定量检测派琴虫的方法。实时荧光PCR检测贝类乘琴虫的疗法敏感度较商,而且特异性强，检测可在一天之内完成，定量准确、余封闭反应等优点。I
1范围
派琴虫病诊断操作规程
GB/T 26618—2011
本标准规定了派 虫病诊断时的样品采巢，虫体培养及显微镜检查,PCR以及灭光PCR检测操作规程。
本标准适用于蛤仔、牡蛎等水生动物及其产品中携带海洋派琴虫（Perissmrinus），奥尔森派琴虫(Perkinsus alsenz)等派琴虫的诊断,也可用于派睾虫病的监测和流行病学调查。2规范性引用文件
下列文件中的奈款随过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注甘期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括误的内容）或修订版均不适用于本标谁，然而，戴励根据本标难送成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088：出人境动物检疫采样3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
派琴虫病Perkinsosis
帕金虫病
由海洋派辜虫（P.marinus）、奥尔森派琴虫（P,seni)等在循上血细胞内寄生或者游离在结缔组织,躯，内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病：往: 除 P, marintus,P.otsent之外,病原还包括 P gugrudi.,P,eherapruli,P, andrruri和 P, madirerraneus.3.2
cycle threshold
荧光PCR反应中，荧光信号到达设定的阅值所经历的循环数，4材料
除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求适到GB/T6682中-一级水的要求。4.1液体巯基乙酸盐培养基（fluid thioglyeollatcⅡcdia,FTM）：具体配制方法见附录A。4.2卢戈氏碘液(Lugal's iodine)配制方法见附录A,4.32.5%氯霉素:配制方法见附录A。4. 41%制穿菌素:配制方法见附录A。4.5酚-三氯甲烷抽提法所需要的相关试剂或其他DNA抽提试盒，见附录A。4.610×PCRbuffer.25mmol/LMgCl2.dNTP(2.5mmol/L或10mmol/L).5U/μLrTaqDNA案合酶等，均为商品化试剂盒中成分。4.7琼脂糖。
4. 8电泳缓冲液:配制方法见附录 A。4.9引物及探针：包括PCR引物及荧光PCR引物和探针。1
GB/T 26618--2011
5设备
5. 1 低温培养箱:能够进行 22 C ～24 ℃培养。5.2生物显微镜。
5. 3一20 ℃普道冰箱、—70 ℃的超低温冰箱、4 ℃冰箱。5. 4 组织研磨器。
5.5高速冷冻离心机。
5. 6 PCR 扩增仪。
5.7荧光PCR扩增仪。
5.8电泳仪。
5.9凝胶成像仪或紫外透射仪，
5.10水裕锅。
6 派琴虫的检测方法
6. 1采样
6. 1, 1采样点的选择
按照GB/T18088规定方法进行。应根据实际情况，一个区域的--个种群至少选取3个采样点，大范围的几块不连续地区或者养殖易您品种的区域，应增加采样点。6.1.2采样技术要求
6,.1.2.1有床症状的负类
牡蛎感染派琴虫的症状表现为消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，性服发育受到抑制、偶尔也会出现胺肿，身体严重衰期，生长迅缓等，采样时，至少挑选10条濑死的或可疑的个体。采样时贝类应当是活的：贝类应当在活体或杀死后分别包装放在冷藏的容器中送到实验室。所来集的贝类样品应避免冰冻。主要采集贝类的鳃,套膜、消化腺、闭合肌等。6. 1, 2. 2 无临床症状的见类当养殖场的个体有怀卵时应每年在产卵期采集-次精液或卵液。如怀卵群体由不同年龄的贝类个体组成，应选取两岁龄的贝类采样。样品丽包括该地所有的易感品种。每次采样的贝类数量要以感染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样。通常情况是至少采集150个贝类，对无临床症状的贝类，取其鳃，套膜，消化腺、闭合肌等，6. 1. 2. 3监测目的的采样
监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能检测到该虫的季节。来样数量参见6.1.2.2。6.1.2.4样品保存及运送
采取的样品应在取样后24h内，冷藏送人实验室，要附有标签，清楚标明采样地点、米源和养殖历史,实验室内冷藏保存备检。
6. 2虫体培养
6.2.1样品的选择
选取垂死的新鲜贝类样品，
6. 2. 2样品前处理
将贝克弃掉，置于灭菌的研钵,前刀剪至1 mm～3 mm大小。6.2.3样品的培养
将样品分别置于含5ml.FTM培养基的灭菌试管中，加250μL2.5%的氯霉素摇匀，用1ml1%制毒菌素覆盖在液面,盖好盖子,22 ~~24 ℃低温培养箱中暗室培养4 d～7 d。2
6.2.4样品的纯化
GB/T 26618-2011
将培养后的样品 4 000 r/min 离心 10 min,弃_E清液,加 6 mL 2 mol/L Na0H,祸旋混匀后置60 C烘箱内消化过夜。4 000 r/min 离心 10 mi,弃上清液.加 2 mL ddH,0 洗涤.4 000 r/min 离心10nin，弃上满箍，重复上迷步骤2次4欢。6.2.5染色镜检
将纯化的样品置于2mLddH，0中摇勾，加人80μL卢戈氏碘液染色后，取40μL于裁玻片上，盖上盖玻片后，在显微镜（10×10)下顺序观察。6.2.6结果判断
显微镜下，经过FTM培养后，派零虫发育为休眠孢子，呈圆形，蓝黑色，直径大多在30μm～80 pm。形态参见附录B，
6.3PCR 检测
6.3.1材料
选取括的或刚死的贝类的懿组织，也可采用乙醇或者低温保存的贝类鳃组织样品。6.3.2操作步骤
6.3.2.1DNA的提取
取25mB样品，剪碎后见附录A中提取组织DNA的方法提取基因组DNA，也可采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。除检测样品外，需要设立姆下对照：．：敢已知感染派琴虫的贝类组织作为阳性对照一取未患病的贝类织作为阴性对照--一空自对照。
6.3.2.2引物
L游引物:5-CCGCTTTGTTTGGMTCCC-3下游引物:5-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3PCR预期扩增派琴虫展的ITS区域片段长度为666bp～672bp(具体序列参见附录C)，引物合成后均采用炎菌ddH.0均稀释为10μmol/L，一20℃保存备用。6.3.2.3反应体系
在 PCR 管内.加入 10XPCR buffer 2. 5 μL,5 U/μL TαQ DNA 合酶 0. 5 μL.10 μmol/L 上下游引[物各 0. 5 uL,2. 5 mmol/L dNTP 2 μL,模板 DNA 10 产L,补充 ddH,O 至 25 μL,PCR操作时,取等体积的 ddH,O代替DNA模板作为空白对照。6.3.2.4扩增程序
95预变性4min之后95℃变性1min，53它退火1min，65℃延伸3min，共40个循环；最后65℃补充延伸5min。
6.3.2.5琼脂糖电泳
取5μLPCR扩增产物，在1×电泳缓冲减内进行1%~2%的琼脂糖凝胶电冰，电泳结束后，用紫外灯或凝胶成像仪观察是否扩增出预期大小的特异性DVA片段。6.3.3结果判定
6.3.3.1试验成立的条件
阳性对照有预期大小的扩增条带，阴性对照及空白对照没有相应片段的PCR产物。否则试验无效。
6.3.3.2样品检测结果
在阳性对照、阴性对照、空白对照都成立的前提下，若检测样品有预期大小的条带，则PCR结果阳性，若检测样品无预期大小的条带，则C结果阴性。3
GB/T 26618—2011
6.4实时荧光 PCR检测
6. 4. 1实验材料与 DNA 提取
材料与 DNA 的提取以及阴,阳性对照及空白对照的设置同 PCR 操作部分。6. 4. 2操作步骤
6.4.2.1引物与探针设计
上游引[物：5'-CAAACTCTCAACGATGGATGCC-3下游引物:5'-TGCAAATCGCAGTGCTTATCG-3TaqMan荧光探针:5-FAM-ACTTCGCTGCGTCCTTCATCGATTCTCG-ECLIPSE-3引物和探针合成后均采用灭菌ddH,0稀释为10mol/L。扩增片段长度为78bp(具体序列参见附录 C)。
6, 4. 2. 2 发应体系
取 10 μL 组织基因组 DNA 作为模板,加人按照表 1 配制的荧光 PCR 反应液中:表 1 荧光 PCR 反应液配制
10X PCR缓冲薇(Mg*+ Free)
25 mmol/L MgClz
2.5 mmol dNTP
上、下游引物及探舒(均为10 “mol/L)等体积混合液5L/μL TaQ DNA 聚合酶
灭茵ddHz
6.4.2.3扩增程序
体积/μL
95℃预变性3nin；然后按照如下程序进行反应：95℃变性15s,57退火1min，43个循环，每个循环结束后采集FAM通道数据。
6.4.3结果判定
6.4.3.1试验成立判定
反应结束后,仪群将自动给出每个样品的 Ct 值：记录 Ct 值,分析检测结果。只有阳性对照有扩增曲线，而且Ct≤35；同时阴性对期无扩增曲线或者扩增曲线Ct>40的，才可判定本次试验成立，否则本试验无效。6.4.3.2阳性判定
如果样品的PCR扩增曲线Ct35,则荧光PCR检测阳性。6.4.3.3明性判定
如果样品无扩增曲线或者扩增曲线Ct≥40,则荧光PCR检测阴性。6.4.3.4可疑判定
如果357检测结果综含判定
FTM培养发现血体，应采用PCR或荧光PCR进行确诊。在 PCR结果可疑的情说下，取 PCR 产物进行测序即可确诊。
A.1样品 DNA的抽提
附录A
（规范性附录）
样品 DNA抽提及溶液配制
GB/T26618—2011
A.1. 1取新鲜贝类的消化腺上皮，腮、触须等组织 25 TmK 置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，滤纸吸干表面水分后称重，置于匀浆研磨器中并如人玲的生理盐水，进行手工勾浆研磨。注意整个过程在球上完成。
A. 1.2将匀浆液倒人 1.5 mL离心管中,加 20 μl.蛋白酶 K(20 mg/mL),再加 SDS至终浓度为 1%：上下颠倒混匀。
A. 1. 3 混合液置于 55 ℃水浴锅内水 2. 5 h。A. 1. 4 向勾浆液中按 1 : 1 比例加入酚+三氧甲烷十异戊醇混合液(25十24十1),上下题倒混勾:12000r/min离心5min。
A.F.5转移上层永相，加人等体积三氯甲烷+异皮醇混合液，上下颠倒混勾，12000r/min离心5 min.
A.1.6转移上层水相,划入滤倍体积的无水乙醇，一20‘C放置 30 min至过夜。A. 1.712 000 1/min离心 5 min+沉淀 DNA,倾去上消液。A,1. 8于沉淀中加人 75%乙醇溶被 500 μL,轻轻滤句后 12 000 1/min 离心 5 min+倾去上清液,室温凉干。
A.1.9用20μI，IE缓冲液溶解DNA沉淀，-20C保存备用。组织DNA提取也可采用等效的商品化IDNA提取试剂盒，按照说明书进行操作A.2电球缓冲液的配制
50倍TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为：取Tris碱 242 g、冰醋酸 57.1mL、0.5 mol/LEDTA1α mL用5 mo1/L的HCl调制pHB,0,定容至1000mL。用前乘用蒸馏水50倍释可A, 3液体巯基乙酸盐培非基(FTM)的配制称取殖基乙酸盐29.75g，放入1L蒸馏水，在微波炉中加热，直到变成金黄色透明液为止，冷却后，分装于10 mL的培辨试管中，每管5 mL，高压灭菌冷却后，用箱纸包裹+放入4 ℃冰箱中保存备用。A.4卢戈氏碘液的配制
取6多碘化钾（KI)于20mLddH.Q中，搅拌到溶解后，加人4g碘，等碘充分溶解，冉加人80mL蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内特用。A.52.5%氧霉素的配制
2.5g氧案索溶解于100mLddH.0中，赔存在试剂瓶内+放人4C冰籍中保存备用。A.61%制霉菌素的配制
1 g 制毒菌素溶解于 100 mL ddH,0 中,贮存在试剂瓶内,放人 4 C冰箱中保存备用。5wwW.bzxz.Net
GB/T26618—2011
附录B
（资料性附录）
派琴虫形态
图B.1未染色的派琴虫休眠孢子（箭头所指）图B.2经卢戈氏碘液染色后的派琴虫休眠孢子（箭头所指）附录C
（资料性附录）
混琴虫PCR及荧光PCR目标扩增序列C.1海洋琴虫ICR扩增参考序列
GB/T26618—2011
CCGCTTTGTTTGGATCCCCCCACCTTAACTTGTTAAGGTGATTAATTCCTATGAACCATTGTACTAGTCATAGTATCCAAATCCAATTTTGGATTTTGGTATTTCAAAACGAAATTCCAAACTCTCAACGATGGATGCCTCGGCTCGAGAATCGATGAAGGACGCAGCGAAGTGCGATAAGCACTGCGATTTGCAGAATTCCGTGAAUCAGTAGAAATCTCAACGCATACTGCACAAAGGGGATCTTTCCTCTTTGTACATACATATCAGTGTCGCTCTTCTTCCCGATACAAACATTTTGTTGTTAACGCAACTCAATGCTTTGTATCCCGCTTGAACTAACTCTTCGGAGGTGGTTCGTTATGTGCGCTTGTGAAGGCAGGCGTATTAATTTGCAAGGCTATAATCTCGTATTGTAGCCCCTCCGAAAGGAGGCTTGCGCCTGTGAGTATCTCTCGAGGTACTCGCAAACTCGACTGTGTTGTGGTGATATCACGTGTTCCTTGATCACGCGATTCTTCTCTTCAACGCATTACGTCAAATCTATTGATAAATGCAGAGAAGTGTTTGAATCACGCGTTCAGTCTGGTCGCGAGATTATTATATATCATAACACGCTTGTCGGTTTGCACCATGGCAATATGTCATCATTAGAAGGCCTGATGTC.2奥尔森派琴虫 PCR扩增参考序列COGCTTTGIT TGGATCCCCC CACCTGAOCA CTCTAACGAG TXGIGTCAAG TGAITATCTOCTAIGAACCA TTGTACTAGT CACAGTATCC AAATCCTTTT GGATTTTGGT ATTTCAAAACGAAATTCCAA ACTCTCAACG ATGGATGCCT CGGCTCGAGA ATUGATGAAG GAXGCAGCGAAGTGCGAIAA GCACTGCGAT TTGCAGAATT COGTGAACCA GTAGAAAICT CAACGCATACTGCACAAAGA GGATCTTTCC TETTTGTACA TACATATCAG TGTCGTCTT CTTCCGATACAAACATTTT GTTGTTAACG CGACTCAATG CTTTGTATCC CGCTTGAGCT AGCTCTTCGGAGATAGTTCG TTATGTGCGC TTGTGACXGC AGGCGTATTA AGTTGCAAGG CTATAATCTTGTATTGTAGC CCCTCCGAAA GGAGGATCGC GCCTGTGAGT GTCTGTGGAT GCTCGCAAGTCCGACTGTGT TGTGGTGATA TCACGTGTTC CTTGATCACG CGATTCTICT CTICAACGCATTAIGTCAAT TCTTGATGAA TGCAGAGAAG TGTTTGGGTC ACGCGTTCAG TCTGGTOGCGAGATAGTTATATATCATAGC --ACGCTTGTCG GTTTGCACCA TGGCAAATTG TCATCATTAGAAGGCCTGAT GT
C, 3荧光 PCR 目标扩增序列
CAAACTCTCAACGATGGATGCCTCGGCTCGAGAATCGATGAAGGACGCAGCGAAGTGCGATAAGCACTGCGATTTGCA
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。