【商检行业标准(SN)】 进出口危险化学品安全试验方法 第3部分：大型蚤繁殖试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2497.3—2010
进出口危险化学品安全试验方法第3部分：大型泽繁殖试验
Test method of import and export dangerous chemicals-Part3:Daphniamagnareproductiontest2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-09-16实施
SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分，第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验；第3部分：大型繁殖试验；
第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第5部分：睾丸细胞UDS试验；
第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第7部分：小鼠耳肿胀试验；
第8部分：胭窝淋巴结试验；
第9部分：血清溶血素测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验：
第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；
第16部分：Western-Blot实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第19部分：NorthernBlot实验；第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分：DNA的Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测凋亡，第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第29部分：生化需氧量（BOD)测定。本部分为SN/T2497的第3部分。
SN/T2497.3—2010
本部分修改采用经济合作与发展组织（OECD)化学品测试指南NO.211(2008)《大型潼繁殖试验》（英文版），其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按GB/T1.1一2000做了编辑性修改。本部分的附录A为规范性附录，附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、陈练、李宁涛、张园、张额。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
进出口危险化学品安全试验方法第3部分：大型泽繁殖试验
SN/T2497.3—2010
SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品大型繁殖试验的试验设备、试验程序、试验质量控制和试验结果。
本部分适用于进出口危险化学品对水生生物的毒性的测定。2术语和定义
下列术语和定义适用于本部分。2.1
亲parentanimals
试验开始时用于繁殖的雌涵。
幼offspring
试验期间亲潼所产的小潼。
内票增长率intrinsicrateofir
综合繁殖量与特定种龄死亡率而测定种群增长能力的参数。稳定状态的种群，内增长率为零。增长的种群，内增长率为正；衰追的种群，内票增长率为负。2.4
效应浓度ECx
引起受试生物繁殖量降低x%时的受试物浓度2.5
最低可观察效应浓度lowestobservedeffectconcentratjon，LoEo与对照相比，对受试生物产生显著(R<0.05)效应的最低受试物浓度。2.6
无可观察效应浓度
noobservedeffectconcentration，NOE试验中直接低于LOEC的受试物设置浓度，即与对照相比，对受试生物未产生显著（P<0.05)效应的最高受试物设置浓度。
死亡mortality
泽体不动，即不能游动，或轻晃试验容器，15s内，没有观察到附肢或后腹部活动。3试验原理
在大型潘繁殖期间，测定受试物对大型死亡率和繁殖的影响。大型在含有不同浓度的受试物溶液中暴露周期为21d，通过对暴露于受试物中的亲潼繁殖量与对照比较，确定最低可观察效应浓度(LOEC)和无可观察效应浓度(NOEC)，以及导致大型强繁殖量降低x%的效应浓度等。1
SN/T2497.32010
4试验仪器
4.1试验容器和其他与试验液接触的器血应为全玻璃制品，或由其他化学情性材料制成。试验容器通常为玻璃烧杯。
4.2需用下列部分或全部试验仪器：溶氧仪；
温度控制仪；
pH计；
测定水硬度的仪器；
测定水中总有机碳(TOC)或化学需氧量(COD)的仪器；控制光照周期与测定光密度的仪器。5试验程序
受试生物
所用物种为大型强（Daphniamagna）：a）无性繁殖系最好用基因型进行鉴定，要求亲所产幼潘的平均值≥60只；b）试验开始时，强龄应不超过24h，且应不使用第一批子代，试验用涵应来自同一健康的储备群体，应无以下反常现象如高死亡率、出现雄涵或冬卵、第一批幼涵产期延迟、体色异常等现象；储备群体的培养条件(光照、温度、培养基、喂食、单位体积中的涵数)须与试验相近；d)
如果试验所用培养基与常规培养所用的不同，正确操作步骤应包括一个为期3周（即一代）的e）
供试前养期。
5.2试验浓度与分组
5.2.1试验浓度：
a）利用受试物的毒性资料，如急性试验和(或)预试验，选择试验浓度。b）通常至少设置5个浓度，按几何级数排列，间距系数不超过3.2，每一浓度应设置适当的平行组。若试验浓度个数小于5，应给于合理的解释。试验浓度最高不超过受试物在试验液中的溶解度。
在浓度设置时，须牢记：
如果旨在获得LOEC/NOEC，试验最低浓度组繁殖量不能明显低于对照；最高浓度组繁殖量应明显低于对照。否则应降低最低浓度或增加最高浓度重新试验。如果要估计影响繁殖的ECx，建议用足够的浓度组来确定ECx及其恰当的置信限。如果估算影响繁殖的ECsn，最高试验浓度应大于ECso。对成龄涵的存活率在统计上有显著影响的浓度不能包括在试验浓度范围内。如果使用助溶剂或分散剂配制试验液，其在试验容器中浓度不能大于0.1mL/L，并在所有试验容器中应一致。
5.2.2对照：
a）应设置试验培养基对照，若使用助溶剂或分散剂应设置助溶剂或分散剂的对照。所用助溶剂或分散剂的浓度应与含有受试物的容器中的一致。所用平行数量应合适。试验中，对照组每只亲谨所产成活幼强的平均数的变异系数应≤25%，应按试验设计中分别培b）
养的涵进行记录。
5.3试验准备
5.3.1试验用水：
试验中应使用规定的培养基，如ElendtM4和M7培养基（见附录A)。a)
SN/T2497.3—2010
如果培养基中含有未规定的添加剂，应明确注明，并在试验报告中给出相应资料，特别是碳含b）
量。应测定含有有机附加物的贮备液中总有机碳(TOC)和（或）化学需氧量（COD)，供估算试验培养基中所提供的TOC/COD量。建议加人满之前的培养基中的TOC<2mg/L。当受试物含有金属时，建议不使用M4和M7培养基。同时避免采用其他含有螯合剂的培养e)
基。可采用替代的培养基，如加有海藻提取物的ASTM新鲜重组水。试验开始与试验期间，溶解氧浓度应大于3mg/L。pH值应在6～9的范围内。正常情况下，d)
任一试验中pH值的变化不应大于1.5个单位。推荐硬度（以CaCO：计)在140mg/L以上。5.3.2
试验液：
a）选定浓度的试验液通常用稀释贮备液的方法配制。推荐将受试物溶解到试验培养基中配制贮备液。
在一些情况下为了配制一个合适浓度的贮备液.允许但应尽量避免使用有机溶剂或分散剂。可用的有机溶剂有丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺和三甘醇。可用的分散剂有聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、0.01%的甲基纤维索甲醚和聚氧乙烯化氢化葩麻油。试验液中的受试物应不超出其溶解度。
5.4试验步骤
5.4.1试验条件
试验条件如下：
试验周期
试验周期为21d。
亲应分开培养，每个容器一只，容器中培养基体积为50mL～100mL；一基于满足测定受试物浓度的化学分析的要求，允许增加培养基体积；若所用体积大于100mL，应增加涵的喂食量以确保有足够的食物；一对于流水式试验，考虑技术原因，可变动设计如分成4个平行，每组10只在一个较大的试验容器中，应记录对于试验设计的任何变化。试验生物
对于半静态试验，要求每一浓度用40只谨，分成4个平行，每组10只，每一试验浓度组与对照组最低不应少于10只动物，并分别培养；对于流水式试验，要求每一浓度用40只遥，分成4个平行，每组10只。可以使用数量更少的涵进行试验，但至少20只，且应该以相同数量分成2个或多个平行（如4个平行每组5只）；
动物按组培养的试验，如果有亲死亡，则不能以试验结束时每只存活亲潘所产存活幼滏总数表示繁殖量，应以试验开始时存在的每只亲涵所产存活幼涵总数表示；试验生物的分配及随后所有操作应按随机方式处理。若试验结果可能受到初始条件或环境条件的影响，应进行空白对照试验。d）喂食
一对于半静态试验，推荐每天喂食，或至少每周三次（与培养基对照进行变化）。由此（如流水式试验)引起的偏差应予记录。一试验期间亲潘的食物可用：小球藻（Chlorellasp.）、羊角月芽藻（Selenastrumcapricornu-tum）和栅藻（Scenedesumssubspicatus），喂食量应以提供给每只亲潘有机碳数量为基础。整个试验过程食物量应在推荐的范围内，即每只涵0.1mg/d～0.2mg/d。推荐范围内的食物量可以在测试期间平均供给，如有特殊要求也可以逐渐增量供给。SN/T2497.3—2010
如果用替代测定法（如藻细胞数量或吸光度）测定喂食量，每个实验室必须作出白已的替代测量指标与藻培养物的碳含量关系的线性图（参见附录B)。线性图每年应至少校验一次，如果培养条件发生改变，校验应更频繁。与细胞计数相比，光吸收法是一种较好的测定碳含量的替代方法。
大型潘应喂食浓缩了的藻液，应避免过多的藻培养液进人试验容器，浓缩藻液可通过离心获得，用蒸馏水、去离子水或涵培养基使其重新悬浮。e）光照
光照16h，光强不超过15μE/（m2·s）～20μE/（m2，s）。f)
试验液的温度在18℃～22℃范围内。对于同一试验，应尽可能使温度变化不超过2℃（如18℃～20℃、19℃～2℃、20℃～22℃）。最好另加一个试验容器，以监测实际水温。g）曝气
试验期间无需曝气。
试验培养基更换
培养基的更换频率取决于受试物的稳定性，但每周至少应更换三次；如果在为期最多3d的稳定预试验中受试物浓度不稳定，即在设定值的80%～120%范围外或下降到初始浓度测定值的80%以下，应考虑增加更换频率或使用流水式试验；半静态试验中更换培养基时，应另准备一套试验系列，同时用口径合适的玻璃吸管转移亲潼。转移涵时应尽量少所吸的培养基的体积。5.4.2观察
试验期间的观察结果应记录在数据表(参见附录C和附录D)上。若需测定其他项目，如亲存活率、初次繁殖时间、内票增长率、亲涵体长产潼批数与每批数量、死胎数、雄涵或冬卵的出现等，需进行其他方面的观察并记录。
5.4.3幼潼
从第一批幼潘出现开始，应每天移出和记数每只亲泽所产幼泽，以避免消耗食物影响亲涵。统计存活幼数量，但出现死胎或死遥也应记录。5.4.4死亡率
应每天记录亲涵死亡数，至少与幼涵记次数相同。5.4.5其他参数
试验结束时测量亲潘体长（即身体长度，不含肛刺）、亲涵第一批产时间（及其余产涵时间）、产泽批数与每批数量、死胎数量、雄谨(雌雄判定参见附录E)或冬卵的出现、种群体内增长率等。5.4.6分析、测定频率
a）新换培养基、原培养基、对照组与最高浓度组中氧浓度、温度、pH值，至少每周测定一次。b）试验期间应定期测定受试物浓度。e)
在半静态试验中，受试物浓度应保持在设定值士20%以内，当重新制备试液及第一周试验期间随机一次更换试液时（重新制备与待更新的应为同一试液中的样品），建议至少应分析最高与最低浓度。此后，应至少每周分析一次。当重新制备与更换试液时，若受试物浓度不在设定值的士20%内.必须分析所有试验溶液当初始浓度测定值不在设定值的士20%内，但可以提供充足证据证明初始浓度是可重复且稳定的，即在初始浓度的80%～120%范围内，第2周～3周内的化学测定可减少到只测最高与最低浓度组，应在每一浓度的一个平行容器被更新之前测定受试物浓度，若采用流水式试验，除无需测定待更新试验液之外，半静态试验中所述采样方法同样适用。在f)
试验第一周，应增加随机采样次数以确保试验浓度保持稳定。应每天检查稀释率及受试物SN/T2497.3—2010
浓度。
在整个试验期间，若证明了被测试的受试物浓度保持在设定值或初始浓度测定值的士20%内，g）
那么结果应以设定值或初始浓度测定值为基础。若偏差大于设定值或初始测定值的士20%，结果应以时间-加权平均(参见附录F)表示。6质量保证与质量控制
6.1试验开始时所用幼雌潘潘龄不能超过24h，且不能使用第一批子代。6.2为确保试验的有效性，对照组应符合以下要求：a）试验结束时，亲潘的死亡率不能超过20%；b）试验结束时，每只存活亲潘所产成活幼涵的平均值≥60%7试验结果
7.1按每个试验容器（即平行)许算每只亲涵所产幼涵总数。任一平行中，若亲在试验期间死亡或转化成雄潼，则应在结果处理时排除此平行。统计分析应以扣除后的平行数量为基础。7.2可用方差分析（ANOVA)计算每一浓度几个平行的繁殖量平均值和组内剩余偏差。应采用合适的多重比较法，如Dunnett和william检验，对每一浓度的平均值与对照平均值进行比较。7.3应采用统计方法（如最小二乘法）；拟合适当的回归曲线。曲线应标明参数，计算ECso、标准误差、置信限。
7.4验证试验的数据分析中，可使用如下的模型作对数曲线图，见式(1)。亦可采用其他模型。1。）
式中：
试验结束时每只存活条强所产幼体息数(对每一容器进行计算）；浓度；
一当主三0时幼体的期望值
X。—种群中的ECso
（1）
b—斜率值。
7.5此模型适用于大多数情况，对于不适合的情况应进行检验。低浓度有促进效应时使用刺激模型是可行的。
7.6也可以估计其他效应浓度，如ECi或EC%，尽管它可采用与估计ECso不同的模型参数。8
试验报告
试验报告应包括下列内容：
受试物
物理性质和相关的物理化学性质；化学鉴定数据，包括纯度。
受试生物
无性繁殖系（如果遗传标记），供应者或来源（如果知道）和所用的培养条件。若使用与大型潼不同物种，应予报告并详细说明理由。c）试验条件
试验程序(如半静态或流水式试验、体积、每升负载涵数)；光照周期与光强；
SN/T2497.3-—2010
试验设计（平行数，每一平行的数)；所用培养基的详细说明；
附加有机物，包括成分、来源、制备方法、贮备液中的TOC/COD、试验培养基TOC/COD的估计值；
喂食的详细资料，数量和食物类型等；贮备液的配制方法和更新频率(若使用助溶剂，应给出其浓度）。d)
关于受试物稳定性的任何试验结果；一设定试验浓度和确定试验容器中受试物浓度的所有分析结果，测定方法的回收率与检测限；
试验容器中的水质（pH、温度和溶解氧浓度，TOC和/或COD、硬度）；每只亲涵所产存活幼潘的完整记录；亲潘的死亡数及其死亡时间；
对照组繁殖量的变异系数(以试验结束时每只存活亲遥所产成活幼谨总数为基础）；最低可观察效应浓度（LOEC)，无可观察效应浓度（NOEC)，若可能，也可记录亲涵死亡的LOEC/NOEC;
-ECx和置信区间，用于计算的模型曲线，剂量效应曲线的斜率及其标准误差；其他可观察或测定的生物学效应，并加以合理的解释；对于试验中任何偏差的解释说明。附录A
(规范性附录）
Elendt M4与M7培养基的制备
A.1对ElendtM4与M7培养基的适应SN/T2497.3—2010
为避免直接转移带来的困难，可通过逐步适应的过程，即将潼从原培养基中取出，放到比例较低的Elendt培养基中，如30%的Elendt中，然后增大Elendt培养基的比例到60%，最后到100%。适应期可能需要一个月。
A.2ElendtM4与M7培养基的制备
首先使用合格的纯净水，如去离子水、蒸馏水或反向渗透水分别配制各微量元素的贮备液I，用贮备液I制备贮备液II，它含有所有微量元素（混合液），在使用前最后加人混合维生素储备液，见表A.1。表A.1ElendtM4与M7培养基配置
浓度（与M4培养
储备液1
(单一物质）
MnCl,·4H,O
SrCl· 6H,0
Na:MoO,· 2H,0
CuCl,·2Hg0
CoCl,·6H,O
Nag SeO,
Na:EDTA · 2H,O
FesO.-7H,0
加人到水中的量/
(mg/L)
Fe-EDTA溶液(2 L)
基的关系）
20000信
20000倍
20000倍
20000倍
20000倍
20000倍
20000倍
20000信
20000倍
20000倍
20000倍
20000倍
20000倍
2000倍
2000倍
1000倍
Na?EDTA和FeSO，两者单独制备，例在一起后立即灭菌。A.3M4和M7培养基配置
为制备混合的储备液Ⅱ把储备液I加人到水中的量/(mL/L)）
M4和M7用贮备液ⅡI配制，常量营养元素和维生素配置，见表A.2。M7
SN/T2497.3—2010
贮备液Ⅱ
（微量元索混合液）
常量营养贮备液（单一物质）
CaCl·2H.0
MgSO.·7H,0
NaSiO, · 9H,0
KH,PO,
混合维生素贮备液
表A.2M4和M7培养基配置
加人到水中的量
(mg/L)
293800
246 600
浓度（与M4培养
基的关系)
1000倍
2000倍
10 000倍
1000信
5000倍
10000信
10-000信
10000倍
10000倍
混合维生索贮备液是把三种维生索加到1L水中制成的如下所示：750
盐酸硫胺（维生素B）
氰钴胺(维生素Blz）
钙长石(维生素H)
o000倍
0:000倍
fo-000倍
加人到制备培养基中贮备液的量/(mL/L)M4
注：当制备培养基时，为了避免盐沉淀，应把适量的贮备液加人到500mL～800mL的去离子水中，然后定容至1L。混合维生素贮备液应以较小分装冷藏保存。附录B
（资料性附录）
总有机碳(TOC)分析与喂食的藻中TOC含量的线性图绘制SN/T2497.3—2010
总有机碳中的碳含量通常不能直接测定，但可替代测量参数的相关性（即线性图)如藻细胞数或光吸收进行估计。对于线性图的绘制，藻应采用离心法从生长的培养基中分离，随后用蒸馏水重新悬浮。在每一浓度用三个平行测定替代参数和TOC浓度。蒸馏水空白应予分析，应从藻样TOC浓度推出TOC浓度。线性图的线性应超过碳含量范围要求。如下面几个例子所示。注：以下仅为示例，不能用于交流；各实验室必须制备自己的线性图。示例1：
(7/)/夏士
示例2：
（7/01)/
东京富在京密富东京药育有育由有司S
儿种绿色小球藻（CCAP211/12）浓绵葬食物干重对以碳计浓缩藻食物量的回归半静态成批培养的藻细胞用蒸馆水重新悬浮后的浓缩藻数据
校正系数www.bzxz.net
50100150J200250300350/400450500559600650700750以碳计浓缩藻食物量/(mg/L）
九种绿色小球藻（CCAP211/12）浓缩案食物细胞数对以碳计浓缩获食物量的回归半静态成批培养的藻细题用蒸馈水重新瑟o
浮后的浓缩藻数据
校正系数
50100150200250300350400450500550600650700750以碳计浓缩藻食物量/(mg/L）
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