【商检行业标准(SN)】 进出口危险化学品安全试验方法 第5部分：睾丸细胞UDS试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2497.5—2010
进出口危险化学品安全试验方法第5部分：睾丸细胞UDS试验
Test method of import and export dangerous chemicals-Part 5:Unscheduled DNA synthesis (UDS) test with testicle cells2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-09-16实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
进出口危险化学品安全试验方法第5部分：翠丸细胞UDS试验
SN/T2497.5—2010
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印剧厂印剧开本880X12301/16印张0.5字数10千字2010年5月第一版2010年5月第一次印刷印数1-1600
书号：155066·2-20925
SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验；第3部分：大型露殖试验：
第4部分：酿酒醇母有丝分裂重组试验；第5部分：睾丸细胞UDS试验；
第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第7部分：小鼠耳肿胀试验；
第8部分：胭窝淋巴结试验；
第9部分：血清溶血素测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；
第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；
第16部分：Western-Blot实验；-第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第19部分：NorthernBlot实验：第20部分：Bradford法测定蛋白质含量：第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分：DNA的Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测凋亡；第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第29部分：生化需氧量(BOD)测定。本部分为SN/T2497的第5部分。
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本部分修改采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南NO.486(1997)《体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按GB/T1.1一2000做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。
木部分主要起草人：李学洋、王利兵、陈庆俊、于艳军、赵琢、周磊。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
进出口危险化学品安全试验方法第5部分：睾丸细胞UDS试验
SN/T2497.5—2010
SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品的率丸细胞UDS试验的术语和定义、试验原理、试验程序和试验结果。
本部分适用于进出口危险化学品诱发动物睾丸细胞DNA损伤和修复的检测。2术语和定义
下列术语和定义适用于本部分。2.1
正修复的细胞cellsinrepair
净核银粒(NNG)高于本试验室历史性阴性对照值的细胞。2.2
拉net nuclear grains,NNG
净核银粒
在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数(NC)减去等于核面积的细胞质内银粒平均数(CG)，即NNG：NC一CG。由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养物中的细胞NNG汇总。
程序外DNA合成
unscheduledDNAsynthesisUDS
在切除含有由化学物质或物理因素引起损害的一段DNA后，进行的DNA修复合成。3原理
睾丸细胞UDS试验是利用哺乳动物作指示生物的体内体细胞遗传毒理学试验，遗传学终点为原发性DNA损伤。由于本试验检测整个基因组，敏感度较高，对本试验提供致突变活性的信息缺乏特异性可能有所补偿。
哺乳动物睾丸细胞UDS试验表明，由化学物质或物理因素诱发DNA损伤区经链切除后的DNA修复合成。本试验通常用放射白显影检测\H-TdR(胸腺嘧啶脱氧核苷)掺人睾丸细胞DNA。与液闪计数法比较，放射自显影法对S期细胞的干扰不敏感。4试验方法
4.1准备
4.1.1动物选择
应该利用常用品系的健康刚成年动物。首选大鼠，也可选用其他适当的哺乳动物。在试验开始时，动物体重差异应不超过每种性别平均体重的士20%。4.1.2饲养条件
动物室的温度应为22℃士3℃，相对湿度一般维持在30%～70%，除非在清洁动物房，相对湿度最好控制在50%～60%。光照采用人工照明，12h明暗交替控制。饲以常规实验室饲料，不限饮水。如果受试物掺人饲料进行染毒，应选择适当的饲料以保证与受试物充分混合。动物可单独饲养或同性别1
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分小组笼养。
4.1.3动物的准备
健康刚成年的动物随机分配到对照组和染毒组，饲养笼也应随机安排，以使饲养笼放置的可能效应减小。动物应适应试验条件至少5d。4.2受试物准备
4.2.1受试物处理
固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂/赋形剂，并于动物染毒前稀释。液体受试物可直接染毒，或在染毒前稀释。应新鲜制备受试物，除非有稳定性资料证明受试物可以贮存。4.2.2溶剂/赋形剂
溶剂/赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应，不应与受试物反应。如利用未充分了解的溶剂/赋形剂，应有其相容性的资料，首选水作溶剂/赋形剂。4.3剂量与分组
4.3.1剂量水平
4.3.1.1通常设2个剂量组。最高剂量应产生毒性，如根据相同的染毒方案更高剂量可产生动物死亡。较低剂量一般应为高剂量的50%～25%在较低的无毒性剂量就有特殊生物活性的物质（如激素和有丝分裂原)可能是剂量设置标准的例外，并应逐例评价。4.3.1.2无充足资料时，应进行确定剂量范围试验应在同实验室利用同一品、系、性别的动物确定染毒方案。
4.3.2对照
4.3.2.1每个试验都应包括同时行的阳性对照和仍性(溶剂/赋形剂)对照。除了受试物染毒不同之外，对照组动物应以与染毒组动物相同的方式进行操作。4.3.2.2阳性对照在暴露水平应预期得到超过本底值的UDS增加。阳性对照剂量应使效应很清楚，但并不使读片者立即发现其为阳性对照标本片。阳性对照的染毒途径可以不同于受试物染毒途径。阳性对照物包括：早期采样（2h～4h），N-二申基亚硝胺（N-NitrQsodimethylamine，CAS号[62-75-9]》；晚期采样（12h16h），2-乙酰氨型苏（N-2,-Fluorgnylacetafmide，CS号［$3-96-3）。4.3.3动物分组数量和性别
4.3.3.1应利用适当的动物数。每组至少有/3只可供分析的劫物。如已有充分的本底对照数据库，则同时进行的阴性和阳性对照组仅需1只或2只动物。4.3.3.2如在进行本试验时，已有资料表明同一品系、相同的暴露途径，在不同性别之间毒性无差别，则用单一性别(优先用雄性)动物即司、当人暴露受试物可能有性别特异性(如某些药物），则应在适当的性别进行试验。
4.4试验步骤
4.4.1染毒程序
受试物通常采用一次染毒。
4.4.2限度试验
如果单次染毒剂量水平或同一天2次染毒（按体重计）至少2000mg/kg，不产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行2个剂量水平的完整试验。人暴露的预期量可表明需要在限量试验中应用更高的剂量水平。4.4.3染毒
受试物通常用灌胃或腹腔注射染毒。如果合理，其他的染毒途径也可接受。一次灌胃或注射染毒的最大液体容积应不超过2mL/100g。若利用更高容积，必须说明理由。除了在较高浓度毒效应增强的刺激性或腐蚀性物质外，应调整浓度使受试物容积减小，保证在所有的剂量水平为等容积。2
4.4.4睾丸细胞制备
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动物染毒后12h～16h制备睾丸细胞。一般要求有早期采样（染毒后2h～4h），除非在12h～16h具有明显的阳性反应。但是，根据已有的毒物代谢动力学资料也可利用其他采样时间。将双率丸去包膜，放人表面皿中剪碎，加人匀浆介质（0.01mol/LTris-HC1缓冲液，pH7.4)，用玻璃匀浆器制成10%的睾丸组织匀浆。4.4.5UDS测定
新分离的哺乳动物睾丸细胞通常在含\H-TdR的培养液中培养适当的时间，如3h～8h。在培养期末，移去培养基后，细胞再培养在含过量未标记胸腺嘧啶的培养液之中，以除去未掺入的放射性：如培养时间较长可免去此操作。然后，细胞再经淋洗、固定和干燥。标本片浸涂放射自显影乳胶，置于黑暗中(如冰箱7d～14d)曝光、显影、染色，计数银粒。每个动物制备2个～3个样本片。4.4.6分析
4.4.6.1标本片应有足够的形态正常的细胞，以进行UDS评价。应在显微镜下检查细胞毒性（如核固缩、放射标记水平降低）。
4.4.6.2标本片应在读片前缩号。每个动物至少从2个标本片计数100个细胞，如每个动物计数少于100个细胞，应说明理由。对S期细胞核不计数银粒，但应记录S期细胞的比例。4.4.6.3以适当的方法计数在形态正常细胞的核和胞质中\H-TdR掺入量，以银粒沉淀作为\H-TdR掺入的根据，
4.4.6.4测定核内银粒数(NG)和与核面积相当的胞质内银粒数(CG)。CG数可以取细胞内标记最多的区域，或从接近核的胞质随机数(2--3)个区域的均值。如果合理，可以利用其他的计数方法（如全细胞计数)。Www.bzxZ.net
5试验结果
5.1结果处理
应提供每张标本片和每只动物的数据。所有的资料应总结成表格形式。由各个细胞、各动物、各剂量和采样时间的NG减丢CG计算净核银粒NNG。如果计数正修复的细胞”，应核实“正修复的细胞”的标准，并根据历史数据或同时进行的阴性对照数据。计数的结果可以用统计学方法评价。如使用统计学方法，应于试验前合理选择。5.2结果评价和解释
5.2.1评价阳性和阴性反应的标准：阳性反应：净核银粒（NNG)高于根据试验室本底对照资料预先设定的阐值；或NNG值高于同a
时进行的阴性对照，并有统计学显著性。阴性反应：NNG在本底对照值的范围内或低于此阔值；或NNG并不显著高于同时进行的阴h）
性对照。
5.2.2应考虑数据的生物学关联，及考虑多种参数，如动物间变异、剂量反应关系和细胞毒性等。可利用统计学方法，以有助于评价试验结果。但是统计学意义不应作为判定阳性反应的惟一因素。5.2.3虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果，但在少见的情况下，所得到的资料不能对受试物的活性进行明确的判断，经多次重复试验，结果仍然是意义不明或可疑。5.2.4由哺乳动物睾丸细胞体内UDS试验阳性结果表明受试物对哺乳动物睾丸细胞引起DNA损伤，此损伤能在体外经程序外DNA合成修复。阴性结果表明在试验条件下受试物不诱导在本试验可检测的DNA损伤。
5.2.5应该讨论受试物或其代谢产物到达体循环或靶器官（如系统毒性）的可能性。5.3试验报告
试验报告应包括下列资料：
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a）受试物
物理性质和纯度；
与进行本试验有关的物理化学性质。b）溶剂/赋形剂
溶剂/赋形剂选择依据；
受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。试验动物
所用动物的品系；
动物的数量、畜龄和性别；
来源、饲养条件、饲料等；
在试验开始时动物的个体体重，包括每组的体重范围、均数和标准差。d）试验条件
阳性对照和阴性(溶剂/赋形剂)对照：染毒途径；
证明受试物到达体循环或靶器官的方法（如进行）；-染毒和采样方案；
测定毒性的方法；
睾丸胞制备和培养方法；
制备的标本片数和计数的细胞数。e)
各个标本片、各个动物和各组的NG、CG和NNG的均值；剂量-反应关系；
毒性表现；
同时进行的阴性(溶剂/赋形剂)对照和阳性对照资料；-本底阴性（溶剂/赋形剂)对照和阳性对照资料包括范围、均数和标准差；“正修复的细胞”数（如测定）；S期细胞数(如测定)；
细胞存活率。
结果的讨论。
结论。
书号：155066·2-20925
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