【国家标准】 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定

中华人民共和国国家标准
GB5413.14—2010
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定Nationalfoodsafetystandard
Determination of vitamin Bi2 in foods for infants and young childrenmilkandmilkproducts
2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
本标准代替GB/T5413.14-1997《婴幼儿食品和乳粉维生素B12的测定》本标准与GB/T5413.14-1997相比，主要变化如下：-标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》。本标准附录A为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB5413-1985、GB/T5413.14-1997。GB5413.14—2010
1范围
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定。2规范性引用文件
GB5413.14—2010
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理
利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillusleichmannii）对维生素Bi2的特异性和灵敏性，定量测定出试样中维生素B12的含量。在测定用培养基中供给除维生素B12以外的所有营养成分，这样微生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素B12的含量相对应。以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中维生素B12的含量。
4试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。4.1菌株：莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillusleichmanni）ATCC7830。4.2维生素B12（VitaminBi2或Cyanocobalamin）标准品：分子式C63Hg8CoN14O14P，纯度≥99%。4.3培养基
4.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录A。4.3.2乳酸杆菌肉汤培养基：见附录A。4.3.3维生素B12测定用培养基：见附录A。注：一些商品化合成培养基效果良好，商品化合成培养基按标签说明进行配制。4.49g/L氯化钠溶液（生理盐水）称取9.0g氯化钠溶解于1000mL水中，分装于具塞试管，每管10mL。121℃灭菌15min。4.5乙醇溶液：体积分数为25%。4.6无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.7无水偏重亚硫酸钠（Na2S2Os）。4.8柠檬酸（含一个结晶水）（C6HgO7H2O）。4.9标准溶液的制备
4.9.1维生素B12贮备液（10μg/mL）：精确称取维生素B12标准品（4.2），用乙醇溶液（4.5）定容至维生素B12浓度为10μg/mL。
GB5413.14—2010
4.9.2维生素B12中间液（100ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）将5.0mL维生素B2贮备液（4.9.1）定容至500mL。
4.9.3维生素B12工作液（1ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）将5.0mL维生素B12中间液（4.9.2）定容至500mL。
4.9.4标准曲线工作液：分别吸取两个5mL维生素B12工作液（4.9.3）于250mL和500mL容量瓶中，用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为0.02ng/mL；低浓度溶液的浓度为0.01ng/mL。注：所有标准溶液要储存于冰箱内。4.9.1、4.9.2和4.9.3保存期三个月，4.9.4临用前配制。5仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1天平：感量为0.1mg。
5.2pH计：精度≤0.01。
5.3分光光度计。
5.4涡旋混合器。
5.5离心机：转速≥2000转/分钟。5.6恒温培养箱：36℃±1℃。
5.7冰箱：2℃~5℃。
5.8无菌吸管：10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器和吸头。5.9瓶口分液器：0mL~10mL
5.10锥形瓶：200mL。
5.11容量瓶（A类）：100mL，250mL，500mL。5.12单刻度移液管（A类）：容量5mL。5.13漏斗：直径90mm。
5.14定量滤纸：直径90mm。
5.15试管：18mm×180mm。
注：准备玻璃仪器时，使用活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器血进行清洗，清洗之后要求在200℃干热2h6分析步骤
6.1测试菌液的制备
6.1.1将莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC7830）的冻干菌株（4.1)活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基（4.3.1)上，36℃±1℃培养24h。再转种2代～3代来增强活力。置2℃～5℃冰箱保存备用。每15d转种一次。
6.1.2将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基（4.3.2）中，36℃±1℃培养18h～24h，以2000转/分钟离心2min～3min，弃去上清液，加入10mL生理盐水（4.4），混匀，再离心2min～3min，弃去上清液，再加入10mL生理盐水（4.4），混匀。如前离心操作，弃去上清液。再加10mL生理盐水（4.4），混匀。吸适量该菌悬液于10mL生理盐水（4.4）中，混匀制成测试菌液。6.1.3用分光光度计（5.3），以生理盐水（4.4）做空白，于550nm波长下测测试菌液（6.1.2）的透光率，使其透光率在60%80%之间。6.2试样的处理
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6.2.1称取无水磷酸氢二钠（4.6）1.3g，无水偏重亚硫酸钠（4.7）1.0g，柠檬酸（含一个结晶水）（4.8）1.2g，用100mL水溶解。
6.2.2称一定量的样品（精确到0.0001g)，含维生素B12约50ng~100ng，用10mL的上述溶液（6.2.1）混合后，再加150mL水，于121℃水解10min，冷却后调pH至4.5±0.2，再用水定容至250mL，过滤。移取滤液5mL，加入水20mL～30mL，调pH至6.8±0.2，用水定容至100mL。最终溶液中维生素B12的质量浓度约在0.01ng/mL～0.02ng/mL，偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03mg/mL。6.3标准曲线的制作
按表1顺序加入水、标准曲线工作液（4.9.4）和维生素B12测定用培养基（4.3.3）于培养管中，一式三份。
表1标准曲线的制作
试管号
水（mL）
0.01ng/mL标准曲
线工作液（mL）
0.02ng/mL标准曲
线工作液（mL）bzxz.net
培养基（mL）
6.4待测液的制作
按表2顺序加水、样品溶液（6.2.2）和维生素B12测定用培养基（4.3.3）于培养管内，表2待测液的制作
试管号
水（mL）
待测液（mL）
培养基（mL）
6.5灭菌
一式三份
将6.3和6.4中所有的试管盖上试管帽，121℃灭菌5min（商品培养基按标签说明进行灭菌）。6.6接种
将上述试管迅速冷却至30℃以下。用滴管或移液器向上述试管中各滴加1滴（约50μL）测试菌液（6.1.2）（其中标准曲线管中空白S1除外）。6.7培养
将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养19h20h。6.8测定
培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种试管S1内培养液应是澄清的，如果出现浑浊，则测定无效。
6.8.1以接种空白管做对照，测定最高浓度标准曲线试管的透光率，2h后重新测定。两次结果透光率差值若小于2%，则取出全部检验管测其透光率。6.8.2用未接种空白试管（S1）作空白，将分光光度计透光率调到100%（或吸光度为0），读出接种空白试管（S2）的读数。再以接种空白试管（S2）为空白，调节透光率为100%（或吸光度为0），依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度）。3
GB5413.14—2010
6.8.3用涡旋混合器（5.4）充分混合每一支试管（也可以加一滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色Ⅲ内进行测定，波长为550nm，待读数稳定30s后，读出透光率，每支试管稳定时间要相同。以维生素B12标准品的含量为横坐标，透光率为纵坐标作标准曲线。6.8.4根据待测液的透光率，从标准曲线中查得该待测液中维生素B12的浓度，再根据稀释因子和称样量计算出试样中维生素B12的含量。透光率超出标准曲线管S3～S10范围的试样管要舍去。6.8.5对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率计算每毫升该编号待测液维生素B12的浓度并计算该编号待测液的维生素B12浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%，超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液中维生素B12含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为Cx。用于计算试样中的维生素B12含量注：绘制标准曲线，既可读取透光率（T%），也可读取吸光度（A）。分析结果的表述
试样中维生素B12的含量按公式（1）计算：x
式中：
X—试样中维生素B12的含量，单位为微克每百克表示（μg/100g）；C6.8.5中计算所得的总平均值，单位为纳克（ng)；m
-试样的质量，单位为克（g）：f稀释倍数。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%9其他
本标准检出限为0.1μg/100g
A.1乳酸杆菌琼脂培养基
A.1.1成分
附录 A
（规范性附录）
培养基和试剂
GB5413.14—2010
番茄汁100mL，三号蛋白陈7.5g，酵母浸膏7.5g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾2.0g，聚山梨糖单油酸酯1.0g，琼脂14.0g，水1000mL，pH6.8±0.1（25℃±5℃）。A.1.2制法
先将除琼脂以外的其他成分溶解于蒸馏水中，调节pH，再加入琼脂，加热煮沸至完全溶解。混合均勺后分装试管，每管10mL。121℃高压灭菌15min，备用。A.2乳酸杆菌肉汤培养基
A.2.1成分
番茄汁100mL，三号蛋白陈7.5g，酵母浸膏7.5g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾2.0g，聚山梨糖单油酸酯1.0g，水1000mL，pH6.8±0.1（25℃±5℃）。A.2.2制法
先将上述成分（A.2.1）溶解于水中，调节pH，加热煮沸，混合均勾后分装试管，每管10mL。121℃高压灭菌15min，备用。
A.3维生素B12测定用培养基
A.3.1成分
无维生素酸水解酪蛋白15.0g，葡萄糖40.0g，天门冬酰胺0.2g，醋酸钠20.0g，抗环血酸4.0g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.4g，硫酸腺嘌呤20.0mg，盐酸鸟嘌呤20.0mg，尿嘧啶20.0mg，黄嘌呤20.0mg，核黄素1.0mg，盐酸硫胺素1.0mg，生物素10.0μg，烟酸2.0mg，p-氨基苯甲酸2.0mg，泛酸钙1.0mg，盐酸吡哆醇4.0mg，盐酸吡哆醛4.0mg，盐酸吡哆胺800.0ug，叶酸200.0μg，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.4g，氯化钠20.0mg，硫酸亚铁20.0mg，硫酸锰20.0mg，聚山梨糖单油酸酯（吐温80）2.0g，水1000mL，pH6.0±0.1（25℃±5℃）。A.3.2制法
将上述成分溶解于水中，调节pH，备用。
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