【化工行业标准(HG)】 稳定性同位素15N标记的三肽

ICS71.080.99
备案号：27305—2010
中华人民共和国化工行业标准
HG/T 4106—2009
稳定性同位素15N标记的三肽
Stableisotope15Nlabelledtripeptide2009-12-04发布
2010-06-01实施
中华人民共和国工业和信息化部发布本标准的附录A为资料性附录。
本标准由中国石油和化学工业协会提出。本标准由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会(SAC/TC105)归口。本标准由上海化工研究院负责起草。本标准主要起草人：杜晓宁、宋明鸣、李美华、刘卫霞、张亮。本标准属首次发布。
HG/T4106—2009
1范围
稳定性同位素15N标记的三肽
HG/T4106--2009
本标准规定了稳定性同位素15N标记的三肽的技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。
本标准适用于以相应的氨基酸为原料，通过Fmoc固相肽合成法制备的稳定性同位素15N标记的三肽产品。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T601化学试剂滴定分析（容量分析)用标准溶液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20622—2006稳定性同位素15N无机标记化合物3符号与缩略语
3.1同位素原子的表示：mA
其中A表示元素符号，m表示该元素的同位素的原子质量数。例如：15N表示氮元素中质量数为15的同位素氮原子。
3.2同位素丰度的单位表示：atom%mA表示A元素的质量数为m的原子占A元素的原子百分数。例如：atom%15N表示质量数为15的同位素氮原子在氮元素中所占的原子百分数。atom%mA可用缩略形式at.%mA表示。4技术要求
4.1产品的技术要求应符合表1的要求表1产品的技术指标
15N标记的三肽质量分数/%
15N同位素丰度/(at.%15N)
5试验方法
优级品
白色粉末
标明值
合格品
白色粉末
标明值
本实验方法所用试剂、溶液除另有规定外，均应符合GB/T601和GB/T603中规定的要求，高效液相色谱分析用水应符合GB/T6682中一级水规格，其余实验室用水应符合GB/T6682中三级水HG/T 4106—2009
规格。
除外观以外，各技术要求同时做三份平行样品的测定。5.1外观
目视检测。
5.2含量高效液相色谱法。
5.2.1方法原理
高效液相色谱法测定三肽含量：用天然丰度氨基酸作为外标，测定15N标记三肽中相应15N标记氨基酸的含量，即为三肽的含量。三肽中各氨基酸之间以肽键(一NH一CO一)相连，肽键在盐酸中会发生断裂，水解而形成游离氨基酸。氨基酸的N-端氨基在缓冲液存在的条件下与2，4-二硝基氟苯(Sanger试剂)衍生生成黄色的2，4-（二硝基苯基）氨基酸，可在适当的色谱条件下进行定量检测。5.2.2试剂和材料
盐酸：分析纯；
5.2.2.2苯酚：分析纯，需重蒸馏；5.2.2.3氨基酸对照品：生化试剂，其氨基酸含量不小于97%；5.2.2.4乙腈：色谱纯；
5.2.2.5盐酸水溶液：1+1；
5.2.2.6乙水溶液：3+1；
乙酸钠溶液：0.05mol/L；
5.2.2.8苯酚盐酸溶液：向100mL盐酸溶液（1+1)中加人1mL苯酚，混匀；5.2.2.9盐酸溶液：0.1mol/L，量取9mL盐酸注入1000mL水中，摇匀；5.2.2.10碳酸钠缓冲溶液：pH=9.0,将0.2mol/L的碳酸钠溶液与0.2mol/L的碳酸氢钠溶液按1：9的体积比混合，摇匀；
5.2.2.11磷酸氢钠缓冲溶液：pH=7.0,将0.2mol/L的磷酸氢二钾溶液与0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液按6：4的体积比混合，摇匀；5.2.2.12衍生试剂：1%2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液。5.2.3仪器和设备
通常实验室用玻璃仪器及设备；5.2.3.1
高效液相色谱仪，配备紫外检测器；恒温干燥箱，可控制温度（150士5）℃；5.2.3.3
5.2.3.4水解管：玻璃小管，Φ5mm×50mm；反应瓶：耐压螺盖硬质玻璃瓶，体积20mL～30mL；5.2.3.5
真空干燥箱，温度可调节，真空度可达一0.1MPa；5.2.3.6
涡旋混合器；
5.2.3.8天平：十万分之一。
5.2.4分析步骤
5.2.4.1样品水解
称量（0.5~1.0）mg15N标记三肽试样，精确到0.01mg。称好的样品置于水解管中，再将水解管置于干燥反应瓶中，30℃真空干燥1h。向反应瓶中加入苯酚盐酸溶液，用氮气置换瓶内空气15s，迅速拧紧反应瓶螺丝盖。将反应瓶置于（150士5）℃的恒温于燥箱内水解2h，取出冷却至室温，将水解管外壁的盐酸擦去，放入另一干燥反应瓶中30℃真空干燥3h。同时称取与15N标记三肽水解得到的氨基酸量相当量的氨基酸对照品，采用同样的方法进行水解，真空干燥。5.2.4.2样品衍生
HG/T4106—2009
从干燥反应瓶中取出水解管，加入0.1mol/L盐酸溶液50μL、碳酸钠缓冲溶液200μL，涡旋混合，再从中吸取100μL至1mL离心管中，加人衍生试剂（5.2.2.12)100μL，涡旋混合后放入水浴箱中，60℃水浴反应1h，取出水解管。冷却至室温，加人磷酸氢钠缓冲溶液800μL，涡旋混合。采用同样的方法处理氨基酸对照品水解产物。5.2.4.3样品测定
待高效液相仪器稳定后，将5.2.4.2处理得到的氨基酸对照品衍生液和15N标记三肽衍生液利用高效液相色谱仪测定试样的含量。5.2.4.3.1色谱条件
色谱柱：C18（200mmX4.6mm，5μm）；柱温：30℃；
进样量：5μL；
检测波长：360nm；
流速：1.0mL/min；
流动相：A为乙腈水溶液，B为醋酸钠溶液；洗脱条件：梯度洗脱，梯度表如表2。15N标记三肽液相分析梯度表
时间/min
流速/（mL/min）
5.2.515N标记三肽的含量计算与表述非15N标记三肽的含量按以下方法得到。15N标记三肽水解液中待测氨基酸的浓度按式(1)计算：C
式中：
H——三肽水解液中待测氨基酸的峰高对应值；CsT
氨基酸对照品溶液的浓度，由其物质的量和0.1mol/L盐酸溶液的体积计算可得，单位为毫摩尔每毫升（mmol/mL）；
HsT—氨基酸对照品溶液的峰高对应值。15N标记三肽的含量以X计，数值以质量分数表示，按式(2)计算：X
式中：
C三肽水解液中氨基酸的浓度，单位为毫摩尔每毫升（mmol/mL)；M3p
三肽的相对分子质量；
一水解反应后向水解管中加入溶剂0.1mol/L盐酸的体积，单位为毫升(mL)；一三肽试料的质量数值，单位为毫克（mg）。注：用于计算15N标记三肽含量的M3p中的氮元素的摩尔质量数应按照不同丰度的实际值计算得到。（2）
例：非标记三肽中氮元素的摩尔质量数为14.01,15N丰度97%的标记三肽中氮元素的摩尔质量数=14×(1-0.97)+15×0.97=14.97。3
HG/T4106—2009
5.2.5.1允许差
3次平行测定结果的绝对偏差≤1.0%。5.315N同位素丰度液质联用法
5.3.1方法原理
液质联用测定三肽的15N同位素丰度：利用高效液相色谱自动进样，并分离水解得到的氮基酸组分，在电喷雾离子化的条件下，采用负离子模式测定三肽水解液中的不同氨基酸及其同位素的准分子离子峰强度，根据相关的离子峰强度计算得出待测氨基酸的15N同位素丰度值。5.3.2试剂和材料
5.3.2.1甲醇：色谱纯；
5.3.2.2纯水：电导率<18MQ；
5.3.2.3甲醇水溶液：1+1；
5.3.2.4乙酸铵溶液：0.01mol/L。5.3.3仪器和设备
5.3.3.1通常实验室用玻璃仪器及设备。5.3.3.2液相色谱串联四极杆质谱联用仪：液相色谱应配备紫外或PDA阵列检测器和梯度洗脱泵，质谱应配备电喷雾(ESI)离子源。5.3.3.3高纯氮气，99.999%。
5.3.4分析步骤此内容来自标准下载网
5.3.4.1样品测定
将5.2.4.1处理得到的试样用甲醇水溶液（5.3.2.2)溶解，并加人少量的乙酸铵溶液混匀，抽滤试液，以自动进样方式进行液相色谱和质谱联用检测其15N丰度值。5.3.4.2色谱条件
色谱柱：C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：室温；
进样量：5μL；
检测波长：PDA全波段；
流速：0.3mL/min；
流动相：A相：甲醇，B相：纯水；洗脱条件：等度洗脱，A/B=25：75。5.3.4.3质谱条件
离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI)；喷雾电压：2800V；
雾化气压力：137.90kPa(20psi）；辅助气压力：68.95kPa(10psi)；离子传输毛细管温度：270℃；
扫描模式：负离子模式Q1MSFullScan。5.3.515N标记三肽氨基酸组分的15N丰度计算与表述待测15N标记氨基酸同位素丰度，以E计，数值以at.%15N表示，在质谱测得的总离子流图的各个氨基酸峰最高处选取1～2点得到相应质谱图，取各氨基酸及其相应同位素峰的平均值作为计算相应氨基酸的15N同位素丰度值的依据。根据所得的各分子离子峰的强度值，按式（3)计算其15N丰度值：
E=Im+/=1xnx:011+IM+a1 ×100
IM + I[M+1] + I[M+2]
式中：
ICM+1]———15N标记氮基酸分子离子峰的相对强度；ICM)——未被15N标记的氨基酸分子离子峰相对强度；n———15N标记氨基酸中所含有的碳原子数；0.011-自然界碳元素中13C同位素的含量：I[M+2]——15N标记氨基酸中天然丰度13C贡献的分子离子峰相对强度和。5.3.5.1允许差
3次平行测定结果的相对偏差<0.5%。6检验规则
HG/T4106—2009
6.1以每一次通过Fmoc固相肽合成法制备得到的产品为一批。每批样品的采样，应用清洁干燥的匙勺从容器的四个等分的中间部位等量采样，采样量约为5mg～10mg。混合均匀后装入两个清洁干燥且密封良好的塑料瓶中，瓶上的标签应注明生产厂名、产品名称、批号批量、采样量、采样日期和采样人姓名。一瓶作产品质量分析，另一瓶作为留样，留样应低温保存（冰箱冷冻室即可)6个月。6.2产品检验部门按本标准规定进行检验，所有出厂产品都应符合本标准要求。如果检验结果不符合本标准要求，应重新自该批产品中取双倍样进行检验。重新检验结果中即使有一项指标不符合本标准要求也应判该批产品不合格。
7标志、包装、运输和存
7.1标志
7.1.1每批出厂产品应附有质量证明书，内容有：生产厂名、厂址、产品名称、分子式、净含量、15N的丰度值、产品含量、生产批号、日期、本标准号和检验员签字。7.1.2每个内包装单元上应有标签，内容有：生产厂名、产品名称、分子式、净含量、15N同位素丰度值、产品含量、生产日期。
7.1.3外包装上应印有生产厂名、厂址、产品名称、批号、总质量和本标准号。7.2包装
7.2.1内包装：采用医用塑料瓶或色谱用小样品瓶，瓶子的容积根据客户需求选定。瓶口用铝塑膜封口，塑料瓶盖带有一次性封边。7.2.2外包装：在内包装外用（0.3~0.5）mmPVC塑料膜密封，再用钙塑箱包装。7.3运输和贮存
7.3.1本产品在运输与贮存时，应通风干燥，防止雨淋和受潮受热。贮运温度应不高于0℃。7.3.2本产品经检验合格后贮存期为2年。S
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附录A
(资料性附录)
三肽水解衍生原理
三肽中各氨基酸之间以肽键(一NH一CO一)相连，肽键在盐酸中会发生断裂,水解而形成游离氨基酸。氨基酸的N-端氨基在缓冲液存在的条件下与2,4-二硝基氟苯(Sanger试剂)衍生生成黄色的2,4-(二硝基苯基)氨基酸，可在适当的色谱条件下进行定量检测。O2N
+H.NCHCONHCHCONH-
Na2CO3
NHCHCO2H+HNCHCO2H+
N-(2,4-二硝基苯基)氨基酸
-NHCHCONHCHCONH—..
中华人民共和国
化工行业标准
稳定性同位素15N标记的三肽
HG/T4106—2009
出版发行：化学工业出版社
（北京市东城区青年湖南街13号邮政编码100011)北京云浩印刷有限责任公司印装880mm×1230mm1/16印张
字数13千字
2010年6月北京第1版第1次印刷
书号：155025·0786
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