【国家标准(GB)】 鸡传染性支气管炎诊断技术

1cs11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 23197—2008
鸡传染性支气管炎诊断技术
Diagnostic techniques for avian infectious bronchitis2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T23197-2008
本标推对应于OIE陆生动物诊断试验和疫函手册（2004)2.7.6鸡传染性支气管炎（aviuninfcc-tious bronchitis)，其一致性程度为非等效。在此黏础l，根据国内科研成果增加了反转录-聚合酶链反应和气管环组织培养血清中和试验，用于病原的鉴定和抗体检测，本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和围农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技求委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、华南农业大学。本标准半娶起草人：吴延功、廖明、王志亮，郭译、刘佩兰，志永玲、孙承英。1
鸡传染性支气管炎诊断技术
GB/T 23197-2008
本标准规定了鸡传染性支气替炎病声分离、反转录-聚合酶链反应、微量血凝抑制试验议及气管坏组织培养而猜中和试验等四种诊断方法的技术要求，本标谁适用于鸡传染性支气管炎的诊断和检疫。2临床诊断
：2.1鸡传染性支气管炎鸡的一种急性、接触性传染病；临床.F有多种表现形式，根据病变类型，可将其分为：呼吸道型，肾型等，征以经典的呼吸道型发生的最为普追2.2呼吸道型表裘现为呼吸困难，有罗音或喘鸥音：雍鸡感染可起死亡2.3青年鸡和产蛋鸡感染后，可引起产蛋鸡停产或产蛋下降。表现为产蛋鸡产蛋下降，产软皮蛋、砂壳蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。
2.4肾型表现为病鸡排白色稀粪，脱水；死亡率高2.5符合上述喘床症状之二者叫以怀疑鸡群感染鸡传染性支气算炎病毒，确诊需经实验室检验3
病原的分离
3.1样品的来集
3.1.1对于急性呼吸道型的病鸡，应采取气管渗出物；对于刚扑茶的病鸡则采取支气管和肺组织。3.1.2对于肾型和产蛋下降型的病鸡，应来取发病鸡的肾脏或输卵管。也可从大肠，尤其是育肠扁桃体或粪便分离病声，但从消化道分离到的病未必与现流行或发么的病毒有直接关系。3.2样品的处理
3.2.T将病料放在含有100001U/mL背素和10mg/mL链寇素的pH值为7.4的磷酸缓冰点水(PBS)内置冰盆内送往实验室。pH值为7.4的PBS的配方见附录A。3.2.2将病料磨碎，加含抗菌素的.PBS制成体积分数为20%的凯织悬液，冻融3软；以3000品离心20min，取上清液，加入终浓度为1000.IU/ml的青霉素和终浓度为1mg/mL的链素，37℃下作用1 1 后用于鸡胚接种。
3.3分离培养
3.3.1取病料上清液，接种于5枚9日龄～11日龄的SPF鸡胚尿变腔内，另5枚接种PHS，接种量均为0.2mL/枚。37℃孵育：每天照蛋，24h内死亡的鸡胚弃去。收集接种后3d~7d的鸡断尿液，将所有尿变液混合，用含1000IU/mL青霉素和1mgmL链霉素的PBS稀释5倍～10倍，继续在鸡还内传代，典型的野毒株通常在鸡胚中传至第2代或第3代时，见侏儒还，传至第3代，某些鸡胚可山现死亡。含毒尿要液暨一60·℃以下可长期保存；也可以冻千4℃保存3.3.2将分离物经鸡胚传至3代或3代以上，收获接种后7d仍存活的鸡胚，取胎儿，用剪刀剪除胎儿休外的附属物，并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如接种胎儿重量比对照题最轻胎儿重量少2以上者，可初步判定为有病毒感染，3.3.3：对病的进一步鉴定可通过反转录-案合酶链反应（RT-PCR)进行（见第4章）4反转录-聚台酶链反应（RT-PCR)A.1核酸抽提
4.1.1材料准备
4.1.1.1被检样品：所采的病料（肺或肾等组织样品、棉拭子、尿变液和细胞培养物）应新鲜，或者置GB/T 23 197—2008
于—20℃或一70“低温沫箱保存。4.1.1.1.1组织样品的处现：往1g~3g肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的0.85为生埋盐水研磨成5借～10倍悬浮液，反复冻融2次～3次后，以1000g离心10min，取上清液作核酸抽提用。4.1.1.1.2棉拭子的处班：将棉拭子充分捻动拧十后除大拭了,0.5mL样品液经4000g离心10tui,取上清液件核酸抽提用，
4.1.1.1.3细胞培养物，取1mL细胞培养物反复冻融2次-~3饮后，以4000g离心10min后取上消液作核酸抑提用。
4.1.1.1.4阴性尿囊液：10日龄SPF鸡胚尿密滤m4. 1. 1 1.5
4. 1. 1, 2
4. 1. 1. 3
4. 1. 1. 4
4. 1. 1. 5
4. 1. 1.6
阳性病毒液：传染性支气篇熨病群M41株接种109附龄SPF鸡胚，育18h后收获的尿异芮醇。
灭菌 1. 5 mL 离
无 RNA嗨(
一氯甲烷（编
无RNase
4.1.2操作方法
4. 1. 2. 1100
药76%
或阴性细胞培养灌和传染性支气骨液，剧烈合样品
4. 1. 2. 2 人 24
4.1.2.3吸取5
4℃下以 10 000g
4. 1. 2.4 小心葬
4℃下以7500g离
4.1.2.5弃去全
4.2反转录(R)
4.2.1材料准备
室温放置5
三氯甲烷，
上镖水祖于
tti mitu
部上浓，
风于 5 m
4.2. 1.1反转录酶（
A1标阳性病毒
5 mL灭菌离心管中
1se)XL(A
红离心管管，间设立阴性尿装液，再分别人9冰冷的裂解
，下以100%g离心15mim
c0μ完丙等，1放臀10mit
乙再溶液上博轻缓颠倒尚次，
核糖糍抑制黏（Rsin)和反转录引物。反转录引物为G个碱基鑫厚随机物，序列为S'dCNNNNNN）3'其率N代表A或C或G或T四个碱基。
4.2.1.210mmol/LdNTP
4.2.1.30.5L火菌PCR管。
4.2.2操作方法
4.2.2.1在一个洁净的0.5mL灭菌PCR摩中郝×AMV缓冲液2 μl.,10 mtnol/L dNTPs0.5μL反转录引物20pmol,核糖核酸酶抑制剂(RNasin)10U,反转录酶AMV2.5U.用无RNase水补足总体积25证，轻缓混勾。
4.2. 2.2用 4.2.2. 1中的反转录混合液重悬4. 1. 2. 5}+制备的RNA,置于室温10 min.4.2.2.3放人42℃水浴1h，取山冰浴2min,所得的反应液为反转录产物cl)NA。然后将cDNA置于一20 ℃保存或直接做 FCR，4.3核酸扩增
4.3.1材料准备
4.3.T.1Tag酶，2.5mmal/I.dNTPs，100bpDNA分子质最标准。4.3.1.2
PCR混合引物4PS：包括两对引物（Ms/Mx和3s/3°x），分别针对传染性支气管炭病毒2
品伙伴网http：//foodmate.neGB/T23197-—2008
(IBV)基因组的M基因及基因组3'来端的非编码区，这两个基因区间保守能强。在该混合引物中；Mx/Ms的引物浓度为4Pmol/μL，3's/3'x的引物浓度为5pmol/uL，引物序列如下：3's:5'GGA AGA TAG GCA TGT AGC TT 3'(20 nt);-3'x: 5'CTA ACT CTA TAC TAG CCT AT 3'(20 nt) ;-Ms:5'CCT AAG AAC GGT TGG AAT 3'(18 nt):MX:5'TAC TCT CTACACACA CAC3'(18 nt).4.3.1.3.0.5mL灭菌离心管，
4.3.1.42.0%琼脂糖凝胶（含0.5g/益L溴化艺锭）,其配制方法见附录A。4.3.2操作方法
4.3.2.1在一个洁净的0.5mL灭菌PCR管中依次加人无RNase水18.5uL，1o×PCR缓冲液2.5μL,2.5mmol/LdNTPs2uL,4PSPCR混合物1.5μL+2.5UTa海0.5μL,轻缓泥勺4.3.2.2·加人2L4.2.2.3中制备巾的cDNA；轻缓混匀。4.3.2.3置于PCR仪中运行，943min，94℃40s，53℃30s，7230s,30个循坏，72℃7mini：同时，设立以传染性支气管炎病毒M41株的cLNA为模板的阳性IBV病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养物的NA为模板的朗性对胀4.3.2.4PCR产物的检测：特PCR发应结束后每个PCR样品取5μL于含0.5μg/mLEB的2:0%琼脂糖凝胶孔中电泳，间时加人5.μ标100 bpDA分了量标推物作为蚕照。在75忆乐电泳30min;取凝胶置子紫外灯下观察戴戒像。4.4检测与判定
4.4.1附性对照在约740bp和290bp处分别有·条特异的DNA条带，阴能对腹则无相应的特异条带出现，厕实验成立：
4.4.2待检样品在相应位置如山现特异性条带，或者仅在约740.bp出现条带或者仅在约290bp处出现特异条带，则均可判为阳性。4.4.3如果需要进一步验证的话，可将获得的人小约为740bp或290bp的PCR产物回收纯化后测序，将测序结果提交美国国家生物技术信息中心（NCBI)进行BLAST分析。如果3T.AST结果显示：人小为740bp的测定序列与基因数据库（(renBank中注册的IB膜蛋门序列同源性最高，或者小约为290bp的测定序列与GeriBank·中注册的BV基因组3'末端序列同源性最高，划进一步确证检测结果阳性
5.微量血凝抑制试验
5.１准备
5.1.1:器材
5.1.1..1微单反应板196孔，V形底，间一次试验使用的区应板孔底角度应相同，5.1.1.2塑料采血管：内径2mm，长10c。5.1.2试剂
5.1.2.1稀释液：PH7.4磷酸缓冲盐水(PBS)5.1.2.2．浓缩抗原：由指定单位提供，按说明书使用，置4℃保存，5.1.2.3标准性而清：由指定单位提供，按说明书使用。5.1.2.4阿氏液（Alsever)，配制方法见附录A，5:1.2.51%鸡红细胞悬液：采不少于3只健康成年鸡血液；以1：2的比例与阿液滬匀，用20倍量PBS洗涤3次～4次，每次以1500g高心5min，最后一次10min，用PBS配成体积分数为1%的悬液。5.1.3被检血清
刺破鸡羽下静脉，用毛细塑胶管导进血流6cm~8cn长；烧融二端，轰夹封口。血液凝固析出f消3
GB/T 23197—2008
后1500g离心5min，剪取血消端，封口备用。注：普查跃病流行时，每群来血鸡不少于30只。5.2操作
5.2.1微量血凝试验
5.2.1.1于V形血凝板的每孔中滴加PBS25μL，共滴四排。5.2.1.2吸取抗原滴加于第一列孔，每孔25L，然活按由左到右顾序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸25L弃之。最后-列不加抗原作对照。各孔补加PBS25。5.2.1.3了每孔中加人1%红细胞悬液25产置微基混个器上搬荡1mi。5. 2. 1. 4
放室温下（22\℃.~25℃）40m后根据血图像判整结果5.2.1.5凝集程度的判定
完全凝集（++)：V
机的尖部开红细胞沉淀块：
b）不完全凝集（「）
形的类部有较明显的红细胞沉流块，但整孔底散布铰多的凝集红e）不完全沉淀（
腰孔的尘
：红轴胞都
d)）完伞沉(-
的抗屌
5. 2. 1. 6
结果。
倍数。
以出现完
计党出等
血凝单位
微量血凝晶身影验
u分别加人
5. 2. 2. 1
吸取被
弃25 μ。
趣精25于
除第1剩孔看加抗原外，
置宝温量30min.
5. 2. 2. 4
25 μL
第1刻孔基
作对照。
细胞悬藏
服孔：
红细胸凝集程度的
将而凝滴度
5乳微量而凝板的客
血斑节莅的抗原
医其他部分有有量凝集红细胞散布：分无可的缝细跑，
每次放四摊，以几何均值表示
4个血单的抗原应稀释的
乳，依次倍比晞释第11孔，最后入第 2 列鲁第厚列各孔。
10 rmin读果，
还应设色知織度的标准阳性,血清同5.2.1.5的规定；
血凝抑制试验结果的在抗原对照出现完全凝集，血清刺解出魂完全沉淀的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最爽稀释榨数为该班清的血凝押葡滴度若鸡群没有接利过鸡传染性支气管炎疫苗，且有的鸡血清滴度达到饮上，说明鸡群受传染性支气管炎的感染。6气管环组织培养血滑中和试验
6. 1 衬料准备
6.1.1器材
眼科剪、服眼科镊子、血、吸管、薄青霉素瓶（5ml.,10mL）、注射器、离心管、超净T作台、37℃培养箱、倒置显微镜、冰箱。
6.1.2试剂
Haniks液、0.4为酚红溶液、7%碳酸氢钠于37℃温箱赚宵率18月龄～20日龄4
合品伙华网hn：/
6.1.4抗原
按说明书使用，置一70℃冰箱冻结保存，6. .5 血清
6.1.5.1标准阳性血清：按说明书使用，用前经56C灭能30min。.6.1.5.2标准附性血清：按说明书使用，用前经56℃灭能30minCB/T23197-2008
6.1.5.3被检血消：每群鸡随机采取10份~20份血释；分离血清。6.1.5.4采血法：用灭菌注射器经心脏无菌采血2mT.~3tmL，迅速移人灭菌离心管内，待凝固析山血满后，以1500g离心5min，将血清移入青宽索航内pd验前将而清经56C火能30min后备用。：6.2操作方法
6.2.1气管环组织培养（TOC
取18日龄～20日龄的码胚，用碘配消毒气案部位，于超工作合降打开蛋壳，用无菌眼科疆子楼开蛋壳膜和绒毛尿囊膜尿出鸡胚，置于灭菌的血内。用眼科剪剪来鸡胚颈部皮肤，找出气管，存细地去除气管周围的练
金和脂，取出气管于含100U/mL.青霉和10Pg/mt.链藓素的Hank's液中轻径洗两次，然诺角助释剪将素瓶内，加入含2%
出管例置显微镜工
皮完整、纤毛运动
6.2.2：传染性素
髓机从—7
10稀释，每个
实牛噬清的上
观察新
最康即可供作
气管炎病毒对
籍中敢出
的培养液：
每个加入稀释球
作为空白
6: 2.3：TOC-F者显判定
6.2.3.1.气管怀组象培养出现
+4:叠等
b）+;气
土：气管裂
d）一:气管
组织培养
织培养物
培养物质
经籍养物厂
6.2.3.2坂培养6
显微镜下观察，并记录
“士”或“一”的计为不感桑
6.2.3.3按Reed-Mnench
窄炎病毒
培养半数感
置37℃温箱内培养
个纤毛运动
环维培养物，振漆
去黏附在
个气管环组织置于一个青露
培繁箱内培养24h后，瑕Www.bzxZ.net
于液体隆
D品)的摘定
见气管环组织培养物上
培养液(p值72~7.4)按10-1至
不按种病毒的与
世管环纽织培养物，
到定结果。
皮细胞不家全脱露；
皮细胞素脱灌
馨物黏膜表厚的黏性分泌物，置创置制定结果时，以气管环组织培养物表现“算QC-IDso参见附录 B。
卜”的计为感染，以表现
6.2.3.4将气管环组织培养(TOC)试验重复萍做二缺计算出四淡测定果的几何平均值。该平均值即为该批抗原滴度，受70℃可使思一年，很抗原严禁反复练融，6.2.4.气管环组织培养血清中和试验采用恒单病毒、变鼠血清的中和试验方法。将得检血消用不含续牛血清的MEM培养液先作1：10稀释后，再作倍比缔释，如1：2,1：4，，7：256等。取衔个稀释度的血清2.5mL，如人2.5mL200个TOCID病毒，充分混匀后置37℃温箱内感作1h,每个滴度的混合液分别接种于5个气管坏组织培养物，使每个气管环组织培养物没于1mL混合液中：置37C培养箱内培养6d后翔定结果。6.2.5对照
在进行中和试验的同时，设以下对照：病毒对照：将抗原用Hank's液帮释成每个接种剂量含10-\个～10°个TOCiDs，每个滴度a)
接种丁5个气管环组织培养物，接种量为1mL，b）而清毒性对照：将低倍释释的符检血清加人5个气管环组织培养物，每个加1mIhttp：/
fnodmatai
GB/r 23197—2008
c）气管环组织培养物空凹对照：取5个气管环组织培养物，各加人1mL培养液；)阳性血清和阴性血清对照：与待检血清进行平行试验，操作步骤同6.2.4。6.3结果判定
6.3.1气管环组织培养出现病变的结果判定方法参见6.2.3.1。6.3.2对照试验应山现下列结果：a）气管环组织培养物空户对照，应衣现为“+”或“…”；病毒对照,10|个、10 2个TOC-I)u组应出现“士或“二\,而 10个TOC-ID组必需出1
现\+一”
血清毒性对照,气管环组织培养物应出现“”d）阳性对照而消应呈现预期的小和效价,阴性无[和效价6.3.3在对照结果正常的情说下，记录气管环组织培养物纤毛运动和「皮细跑脱落的情况，以在病毒而清混合作用后能使气管环缅织培养物出“十”的血清的最高稀释倍数为该面清的终点滴度。按Reed·Miench法计算而清的中和效价7综合判定
7.1IBV的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化员叫作出初女诊断，确诊应依靠实验塞检查病靠的分离与鉴定多用上急性病例的确诊和新疫区的确定,RT-PCR适用于该病病原的快速诊断，而清学方法可用于BV抗体的检测和匪清型的鉴定：微量血懿抑制试验体水平上进行血清学诊断较易操作,特异性强、敏感性商。气管环组织培养清中利试验操作复杂，仅适于BV鉴定，7.2当在临床上怀疑有IBV感架时，可根据实际情况·由上述几种法中选用一种或两种方法进行确诊,对了丁末接种过 3V疫苗,经任何一种方法检测呈阴性结果时,都可最终判定为IBV感染鸡群。对接种过BV疫苗并在疫苗免疫期内的鸡或已超过疫苗免疫期的鸡，当病毒分离鉴定试验为性结果时，可整判为BV感染鸡；当仅而清学试验呈性结果时，应结合病史和疫需接种史进行综合判定，不可律视为IBV感梁鸡群：
A.1pH7.4磷酸缓冲盐水(PBS)的配制磷酸氢二_钠(NlzHPO,·12II,O)磷二氢钠(NaH,PO,·2H.G
氟化钠(NaCl)
最上述试剂溶于1000
A.22.0%琼脂糖凝胶
在 100 iL TA离
后加入漠化乙锭（）
阿氏液的綫
葡萄糖C
柠檬酸三铵
柠檬酸(Ch
氯化（N）
加蒸馏水
蒸馋鲜
附梁A
（规范性附录）
试剂配制
甲,68.94 kPa灭茵
μg/mL溴化乙锭）
鑫浓度
mL溶解
Harik's湾的
4.4.1成分
4.4.1. 1母液
A,4.1.1.1溶液
氯化钠(NaC1)
氧化钾(KCI)
硫酸镁（MgSO
氯化镁(MgCl2·6H,C
将上述各成分溶于800m无离子水审A.4..1.7.2溶液2
取氯化钙（CaCh)2.8g，溶子100mL充子A,4. 1. 1.3配制
GB/T,23197--2008
）人2.0g琼脂糖，熔花
备用。
将A.4.1.1.1和A.4.1.1.2两种溶液混合后，加无离了水至1000mL，并加2mL氯甲烷作为防腐剂，保存于0℃～4℃冰箱内。A. 4. 1,2 母液B
磷酸二氢钾（KIHPO）
磷酸氢钠(NtHPO,·12HO)
菊萄糖(CHU·H.O)
将上述三种成分溶于800mL无离于水中，最后加人10mL0.4%酚红溶液。加无离子水至I 000 mL,加人2mL三氯甲烧防腐，0℃～4 ℃保存。?
GB/T 23197—2008
A，4.2应用液
取母液A、B各1份，无离于水18份，混勾后66.94kPa灭菌15min，置0℃-4℃冰箱内备用。使用时于 100 trL Huμks 液中加 7%薇峻氢钠调 pH 值至 7. 2 ~ 7. 。A.50.4%酚红液的配制
称取酚红置研钵中,遂渐滴入0.1 mol/1,氢氧化钠(NaOH)，不断研磨垒题粒完全溶解，再加人适虽去离子水，使红最终浓度为0.4%。A67%NaCO.的配制
称取7g碳酸氢钠溶于100ml.去离子水中，68.94kPa灭菌15rmin,置0%-~4℃备用。A.7抗菌素溶液的配制
取青霉素1000000IU、链霉素1000000μ，用灭菌去离了水配成100mL的上述两种抗菌素的混合液。分装小瓶，于一20℃冻结保存，使用时100mank液培养液中入此种抗菌素液1m，
B.1TOC-IDg的测定
(资料性附录）
TOc-IDse和血清中和效价滴定的Reed-Meinich法CB/T 23197--2008
将病毒液在灭菌的10ml青霉素瓶内作连续的10倍稀释，即用5mL吸管吸取1mL病衰液，加入己装有9mL的无血清MEM培养液的第1个小青得紊瓶内将混合液充分振药，并另换一支新的5mL吸管，吹打混合后，吸取1mL.移于第2瓶以tiL的199培养液中，史换吸管，如上充分振离和吹打混句后，再吸取1m加人第3瓶，连续如此操作，即可做成连续的一系列10×稀释液，吸取每-蒂释度的病毒液1ml.，加入含纤毛上皮运动良好的气管坏组织养物的考霉素瓶内，每个稀释度的病毒液接种5瓶。于37℃静正培养，遂日观察；其观察5d.按表B.1所举例子计算TOC1。表B.1.TOC-IDsi的测定和计算（Reed-Meinch法）病毒滴释度
观察结果
病变 TOC数
正常 TCC 数
病变 TOC数
正常TOC数
TOC 总数
出现变的掷数
所占面分率/张
100[28/28)
100<23/233
1018/18)
100(13/13)
88.9(8/0)
57.1(4/7)
-12.5(1/8)
0(0/12)
0(0/17
出现病变的TOC数和正常TOC数分别列于表B.1的第2列和第3列，它们的累计数分别列于第4和第5列（根箭头所示方向），第6列为TOC总数，第7列为出现病变的TOC数凸TOC总数的百分率。可见该病毒株的TOC-ID品在105（57.1%）和10-（12.5%)之间，其确切稀释倍数可按下列公武让算：
57.1%（商了=50%的直分数）—50%=0.16
·57.1%（高手50%的臂分数）=12.5岁（低亍50%的首分数）因此该病垂的 TOC-ID应是10-n.1 /mL。查反对数,得 144.5 000,即该病毒 1 445 000稀释可保护50%的气管环组织培养物免于出现病变：B.2滴定血清中和效价的Keed-Meinch法取200个TOC-ID；：的病毒液，加人等量不同稀释度的待检血清，充分混合并感作后，接种TOC,按表B.2示例计算血清中和效价。
http
.foodmate.ne
GB/T23197—2008
血消稀释度
(病蛋固定）
1 : 4(10-0*)
1 : 16(10 1.}
1+64(1c1)
1 : 256(10-2.1)
1 : 1 024(10-)
感染TO数
2固定病毒稀释血清法示例
正常10心数
感梁比例
保护率/光
按Rcced-Meunch法计算，血清稀释度介于10-=-.23和10-1.9之间时能保扩50%1OC免受感染，距离比例(85.7—50)/(85.733.3)—3.7/52.4=0.68商于50%保护率血清稀释度的对数十距离比例×稀释系数的对数- -1. 2-1 0. 68X(—0, 6) = -1. 2-0. 11 =—1, 611.61的反对数一1/40,即1：40稀释的待检血清可保扩50%的10℃免受感染10
品伙伴网http：//foodmate.net
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。