【国家标准(GB)】 养殖鱼类种质检验 第15部分：RAPD分析

ICS 65.150
中华人民共和国国家标准
GB/T18654.15—2008
养殖鱼类种质检验
第15部分：RAPD分析
Inspection of germplasm for cultured fishes-Part 15.RAPD analysis
2008-06-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-10-01实施
GB/T18654养殖鱼类种质检验》分为下列部分：第1部分：检验规则;
第2部分抽样方法；
第3部分：性状测定，
第4部分：年龄与生长的测定；
第5部分：食性分析，
一第6部分：繁殖性能的测定；
--第?部分;生态特性分析;
—第8部分：耗氧率与临界室息点的测定，-第9部分：含肉率测定；
第10部分：肌肉营养成分的测定：-第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定；一第12部分：染色体组型分析；第13部分：同工酶电泳分析；
第11.部分DVA含量的测定；
-第15部分;RAPD分析；
本部分为GB/T18654的第15部分。本部分的附录A,附录B和附录C为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会谈水养殖分技术委员会归时本部分起草单位，上海水产大学，中国水产科学研究院长江水产研究所。本部分主要起草人，李思发、邹明、徐忠法、赵金良、蔡完其。GB/T18654.15—2008
1范围
养殖鱼类种质检验
第15部分：RAPD分析
GB/T 18654.15—2008
GB/T 18654的本部分规定了鱼类RAPD分析的试剂与材料、仪器和设备、样、分析步骤和结果判定。
本部分适用了常见淡水,海水养殖鱼类2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T 18654的本部分的引用而成为本部分的条款。：凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）惑修订版均不适用下本部分·然面，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T18654.1—2002养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GB/T18651.2券殖值类种质检验第2部分：拙样方法3原理
利用10基的随机案核苷酸引物，对样品基因组的·DNA进行PCR扩增：扩增产物进行电泳分离和溴化乙锭染色，根据谱带多态性比较分析，判定鱼类物种的遗传特性，4试剂与材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸缩水或去离子水或相当纯度的水。三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
4. 2氢氧化钠(NaOH)。
4.3氯化钳(NaCI)，
4.4十二烷基磺酸钠(SDS)：
4.5氯化钾(KC1).
4.6氯化镁（MgCl.）。
乙二胺四艺酸二钠(EDTA)。
硼酸。
琼脂糖，
熊罐。
明胶。
藻化乙锭(EB)。
蛋白酶K
RNA酶A(无DNA酶活性）。
4. 16 DNA Marker.
4.17行蜡油。
GB/T18654.15—2008
无水乙醇。
95%乙醇。
70%乙醇。
平衡酚。
三氮甲烷。
异戊醇，
浓盐酸。
Tris-HCI缓冲液配制方法见附录A0.5 mol/LEDTA溶液：配制存摆见附录 A。5 mal/I. NaCl:配制方法地录 A.STE级冲液：配制力法克随录
10%SDS溶液：配摄
20 mg/mL蛋醇
腑录A。
爱：配制方法见附录A。
25 mg/mL. RN&液:西
PCR扩增缓冲（1C×）配
（葛×）：配
TEE电泳缓净液
0. 5 mg/ml莫
加样缓冲
滇酚蓝。
仪器和设备
花链济液
：配制方法
PCR扩增仪a
高速低温离机。
电子天乎,感
紫外透射分机
照相器材，
凝胶成像系统
恒温水裕锅。
烘箱。
Q.0001g。
低温冰箱及普通冰箱
0. 5 μl.~-1 000 uL联择
样品混合器。
微波炉。
高压湿热灭菌锅。
紫外分光光度计。
0.2mL薄壁离心管（PCR扩增用）。1.5mL离心管。
解部用具（镊子、剪刀、手术刀、瓷盘）。5. 17
陶瓷研体。
戒璃组织勾浆器。
一次性手套。
水平电泳仪(1套)。
凝胶灌制平台。
微方选见
5.23凝胶样品梳。
5.24胶带。
5.25肖流电源。
6抽样
6.1试验鱼抽样按GB/T18654.2的规定执行。6.2样品数量为30尾～50尾。
GB/T 18654.15—-2008
6.3取0.1.g肌肉、肝脏，鳍条等新鲜样品平液氮冰及一30℃以下低温保存，或于95%乙醇中保存。
7分析步骤
7.1基固组DNA的提感
取0.1g样品，视袭
400μL STE缓冲液C
鼠而采用尊碎，液氮碾碎或勾
再加人终浓度分别满1%的
15h。
混合液中加影
8 min,吸取上清
0.5h,离心后咳
春积饱和酸
人等体积
青液；人
异闪醇或2倍借
无水艺醇，
#得DNA演
1500g)离心 5
TE溶解,再，
箱保存备用。
使用紫外线度计或琬
ODaa/ODa:值应
为100 ng/μL.
7.2基因组1NA的G扩增
器上缓
双酚、三氮甲烷
浆器磨碎榉品，放1.5 mL离心管内：加人的蛋自K，匀后,56℃作用5h～
-1h，待靠分刘后，10000g离心
车者之比25-24：1)，缓慢转动
离心后吸敢上满液；加人等体积的症，静置srin，低速（1000g~
繁，干燥，加500u无菌重水或
ONA沉症用？0%的Z
ul.,于37℃温育具h后,置于4℃冰电泳检测样
紫外景光光度计检测的
与浓度：
立大于50b。
DNA样品的浓度约
在0.2IL薄壁中下列随R反应混合覆应总体积μL1. 5～3. 0 pLPCR扩增缓冲液,1 μL 2. 5 mmol度混合被,1 μL~2 μL 5 μmol/L 引物 25 露150 ng 基因组 DNA：
0.6 U～1 U Ta 酶。离
如人约30μL石腊汕防止挥发。Www.bzxZ.net
离心后于PCR扩增仪
湿，循环程序为：第一个程序为93℃～ 变性5 mi,第二个程序为
93 ℃～~94 ℃ 45 s,36 ℃ 45 s, ℃ 90 s,4045伞循环后,72 延伸 10 min。扩增产物直按电泳或 4 ℃暂时操存(·般不超过 6 h)至出脉分析7.3PCR扩增样品的电泳分析
1.5%琼脂糖凝胶的制备：称取适量琼脂糖（电泳级）置于二角瓶中，加人TBE电泳缓冲液混勾，在微波炉中加热熔化，需要时可加入滨化乙锭，制成0.5g/㎡LEB染色的凝胶，冷却至55C，倒人包用胶带封好的凝胶灌制平台，插上样品梳。待胶凝固后，从制胶半台上除去封带，拔出梳子，放人电泳槽中，TBE缓冲液高出凝胶表面约1 mm~5 mm。
取10μLPCR扩增产物加适量的加样级冲液，混匀，然后用移液器将样品加人样品孔中，DNAMarker 同时点在旁近的我中。
接通电源，使DNA向阳极移动，在1V/cm～10V/cm的电压下进行电泳。当加样缓冲液中的溟酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。3
GB/T18654.15-2008
用0.5μg/mL的EB染色10min~30min斤在凝胶成像系统上记录（已加人EB染色液的凝胶可以直接在紫外透射仪上观繁、照相）。7.4结果分析
7.4.1种、亚种或地理群体RAPD遗传图谱的建立及导找特征标记引物选摔条带清晰、重复性佳的引物（一般以20个以上引物为准），对每释体30个～50个样本进行PCR扩增。建立该种，亚种地理群体RAPD标谁邀传图谱，并导找出尽可能多的可以用来区分种间、亚种间、地理群体间的特征标记条带。7.4.2种、亚种或地理居群内的遗传相似度的计算经电泳获得基因组遗传图谱，在同·电泳迁移位置上，有DNA扩增条带的计为1没有的计为0，个体间遗传相似度(F)按式(1)计算：2N
式中：
F个体和叫的遗传相似度；
Na一个体和共同拥有的带数：
N”个体所具有的总带数；
N，个体所具有的总带数。
种、业种或地理房群内的平均遗传相似度通过对群体内各个体间的遗传相似度平均而求得，8结果判定
8.1个体测定结果的判定
按GB/T18654.1-2002中6.1的规定执行。1
将所有测定结果逐与该种，亚种或地理酵休RAPI)标准遗传图谱和特征标记条带进行对照，凡符标推规定的判定为合格，凡不符合标准或与标准规定有显著差异的判定为不合格。8.2样品群体的判定
根据8.1的判定结果，计算出被检样品中合格品的百分率。4
A,11 mol/L Tris-HCI 缓冲液(需灭茵)附录A
（规范性附录）
DNA提取液的配制
GB/T18654.15—2008
圾800ml.重蒸水中溶解121gTris碱，用浓盐酸调至pH8.0混匀后加重蒸水至1L。A,20.5 mol/LEDTA溶液(需灭菌)取700mL重蒸水中溶解186.1gNazEIYrA·2H0,用10mol/LNa0H调至pH8.0(约50mL)补加重水至IL。
A,35 mol/L NaCI(需灭菌)
取1000mL重蒸水中溶解292名Nacl。A.4STE缓冲液
80 mmal/L Tris-IICl(pH8.0),200 mmol/I. E[3TA,50 mmo1/L NaCl.A,510% SDS溶液
900㎡L重蒸水溶解100g电泳级SDS,加热至68℃助溶，调节H至7.2，定容至-1L，分装备用。
A. 620 mg/ml,蛋白酶 K 溶液
蛋白酶K20mg溶解→=1mL无菌重蒸水中，分装后20℃保存。A.7 25 mg/mL RNA 酶 A 溶液
25m无DNA酶活性的RNA酶A溶解于1mL无菌重蒸水中，-20℃保存，5
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PCR扩增缓冲液：
（规范性附录）
PCR扩增缓冲液
100mmol/LTris-HClTBE 电泳缓冲液
附录C
(规范性附录）
电泳缓冲液
108 g Tris,55 g 硼酸,40 mL. 0, 5 mol/L EDTA(pH8. 0) .C.2D.5mg/mL激化乙锭溶液
50mg溴化乙锭，100mL重蒸水。
C.3加样缓冲液
0.25%溴酚蓝,10%(质量浓度)糖水溶液GB/T18654.15—2008
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