【国家标准(GB)】 养殖鱼类种质检验 第14部分：DNA含量的测定

ICS65.150
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GB/T18654.14—-2008
养殖鱼类种质检验
第14部分：DNA含量的测定
Inspection of germplasm for cultured fishes-Part 14 : Deterrmination of DNA content2008-06-27 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局国国家标准化管理委员会
2008-10-01实施
GB/T18654养殖鱼类种质检验》分为下列部分：第1部分：检验规则；
第2部分：抽样方法：
第3部分：性状测定；
一第1部分：年龄与生长的谢定；第5部分：食性分析；
第6部分：繁殖性能的测定；
·第7部分：生态特性分析；
第8部分，耗氧率与临界室息点的测定；第9部分：含肉率测定；
第10部分：肌肉营养成分的测定；-第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定；第12部分：染色休组型分析；
—--第13部分：同工酶电泳分析：一第14部分：DNA含量的测定：
第15部分：RAPD分析；..
本部分为GB/T18654的第14部分
本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会演水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位，上海水产人学、中国水产科学研究院长江水产研究所本部分主要起草人：李思发、赵金良、徐忠法、蔡完其、邹曙明。GB/T 18654.14--2008
1范围
养殖鱼类种质检验
第14部分：DNA含量的测定
GB/T 18654.14--2008
GB/T18654的本部分规定了美脱氧核糖核酸（DNA）各量测定的试剂与材料、仪器和设备、抽样、分析步骤和结果判定
本部分适用于常见水海
杰养殖鱼
2规范性引用文件
“下列文件中的筹
件，其随后所有的馈感单不包括协议的各方研究是重
用这些
部分。
GB/T 18551c
GB/T186)养殖鱼类利
试剂与材料
除非另有说准分析中仗信
3.1磷酸氢二钩(NlHPO,)。
3.2二个结晶水
3.3生理盐水0
3.4固定液：3份常
3.5.肝素溶液：浓度
3.6胰酶：浓度为51
二氢钠（
斌化钠（N
人1份选
3.7核糖核酸酶(RNas)
3.8碘化丙啶（PI)：浓度头
本部分鼠条款凡是注日期的引用文本部分
然而，鼓厕根据本部分达成
的引用义件，摄最新版本适用于本成去离子水家相当纯度的水。
3.90. 1mal/L磷酸缓冲液
BS):NagTRla35rH,PO
2.020.3g，蒸馅水定容至1L
4仪器和设备
4.1离心机：转速为50001/min，带温。4.2流式细胞仪。
4.310mL离心管及试管架
4.45ml试管及试管架。
4.5啵管。
4.62mL注射器。
4.75号针头。
4.8锦纶筛网(或涤纶筛网)：规格为80孔/cm。4.9封口膜
GB/T 18654.14—2008
5抽样
5.1试验鱼执样按GB/T18654.2的规定执行。5.2样品数量达10展以上。
5.3用酒精棉球将鱼体尾部待采而部位擦试消毒，用装有少量肝素溶液的注射器在尾动(静)脉处取0. 2 mL1. 0 mL 助液为试样。男用注射器在小公鸡(Galu5 SP. )翅薛脉处取 2 mL 血液作对照用。6分析步骤
6.1样品处理
6. 1. 1采好的血样立即注入装有 5 L生理盐水或磷酸缓冲液的离心臂中,用吸管反复吹吸洗涤。6.1.2500/min离心5mi，待血沉淀后，用吸管将上清液及上层的白血球吸山。6.1. 3如[人牛现盐水惑 PBS吹吸洗踪,离心 5 min,吸除上清被，混勾剩余的「清液及血球，慢慢滴人5 mL固定液中固定,用封口膜封好待用。6. 1. 4
6.2染色
6.2.1固定后的样,包括鱼血样和对照鸡血样,800 r/rmin 离心2 nnin,吸除,上清液,用生理盐水或PBS 制成细胞悬浮液,静止 1 l 以上。6.2.2800 r/nit 离心 2min,吸除上清液。6.2.3每一血样加入1.8mL胺酶液作用10min，再加入1.5mLRNase溶浓作币10min，最后加入1. 5 mL 碘化丙啶溶液染色 15 min 以上,6.2.4用现格为 80孔/cm的锦纶筛网(或涤纶筛网)过滤，并将细胞浓度调到1×1ng个/mL左右备测。
6. 3对照血样及计算方法
6.3.1用鸡红血球(2c=2.3Pg）做标准DNA对照，依各种鱼JDNA含量的不同，可选择内定标或外定标。
6.3.2用流式细胞仪进行测定，每而样测量3000个细胞以上，用流式细胞仪的相关软件处理测得鱼红耻球与对照鸡红血球的消光值。6. 3.3血样的 DNA 含量按式(1)计算：式中：
鱼血样中的 I)NA含量,单位为皮克(Pg);鱼红血球消光值；
鸡红血球消光值。
7结果判定
7.1个体测定结果的判定
按GB/T18654.1—2002中6.1的规定执行。将所有测定结果逐一与标推对照，凡符合标准规定的判定为合格;凡与标推规定有显著差异或不符合标准的判定为不合格。
7.2样品群体的判定
根据7.1的判定结果，计算出被检样品中合格品的百分率，用%表示。2
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