【国家标准(GB)】 干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量的测定 酶-比色法

ICS 67. 00. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T22031—2008
于酪及加工干酪制品中添加的
柠檬酸盐含量的测定
酶-比色法
Determination of added citrate content in cheese andprocessed cheese products-Enzyme-colorimetric method(1S0 12082:1997 Processe cheese and processed checsc products-Calculation of the content of added citrate emulsifying agents andacidifiers/pH-controlling agents, expressed as citric acid, MOD)2008-06-17发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标淮化管理委员会
2008-10-01实施
GB/T22031—2008
本标准修改采用国际标准IS012082：1997加T于酪及其制品添的柠檬酸盐乳化剂和度避
节剂含量(以柠樣酸计)的测定(英文版)。考虑到我国国情，本标准与IS012082：1997的主要差异如下：分析步骤中增加标准曲线的绘制，由试液吸光度测定与标准系列比较定量，不采用国际标准中摩尔吸光系数计算定量；
乳糖含量的测定以试剂空白和试液空白抑除干扰组分和葡萄糖本底值，不采用国际标准中吸光度减最计算：
免去国际标准中预试验和试验报告章条：编写格式、用语遵照我国标准GB/T1.1一2000双标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4：2001&标准编写规则第4部分：化学分析方法》。水标的附录 A,附录 B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。木标推册全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标推负责起草单位：农业部食品质量监督检验测试中心（上海）。本标雅主要起草人：益瑾、韩奕奕、吴榕。http:
１范围
干酪及加工于酪制品中添加的
柠檬酸盐含量的测定，酶-比色法GB/T 22031—2008
本标准规定广干酪及加工干酪制品中添加的柠橡酸盐含量（以柠机酸计)的测定方法：本标准适用于干酪及加工下酪制品中添加的柠檬酸盐含量的测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是往日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用支件，其最新版本适用于本标痛，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T.6682—1992，negISO8696：1987）3原理
测定样品中总柠檬酸盐的含量，扣除原料带天样品中的柠檬酸盐的（以0.04倍乳糖换算），即为样品中添加的柠檬酸盐含量。柠檬酸盐以柠檬酸计4分析步聚
样品中总柠檬酸盐的测定和含量计算按附录A的规定执行。样品中乳糖的测定和含量计算按附录B的规定执行。5结果计算
样晶中添加的柠檬酸盐含盘证以柠檬酸计，数值以质量分数（%）表示，按式（1)计算式中：
样品中总柠檬酸含量，%
一原料乳消粉或乳粉中柠檬酸含悬与乳糖含量的比率（柠檬酸/乳糖）（7—-样品中乳糖含量,%。
许算结果表示到小数点后两位。6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结0.042;
这两个测定值的算术平均值的10%GB/T 22031--2008
A.1范围
附录A
（规范性附录）
干酪及加工干酷制品中柠檬酸盐含量的酶法测定本附录规定了酶法测定干酪及加工于制甲行檬酸盐食量的方法：本渐录适用于叶酪及加工干酪制中柠檬酸盐含量的嗨法过庭A.2原理
柠檬酸盐裂解酶(CL)棕
海（LDH)在还原型烟酰广
酸盐转化为草酰乙酸盐和乙酸盐，装果酸脱氧酶（MDH）和乳酸脱氧二核苷酸（NADH)的存衣下体化脱羧献乙盐以及脱义产物丙酮酸盐·分别转化［-苹巢酸L-乳酸液中NADH的吸光厦差值计算样
A.3试剂
所有的试剂如参注期规格，均
A 3.1 三氯乙吨
/200g/L)：
A.3.2氢氧化200g/L)：
定容．充分混合
A.3.3氢氧化餐40g/L)：科
容。充分混合。
A. 3. 4 氧氧化谢管游量g/L):称穿，充分混合。
A.3.5氯化锌落溶液霜
容。充分混台。
/L)：称
实验用求如求浮
化钠（NaO
在40nm处测定样品熔
时合GB/T6682的规定
于水中，混，并定容至100mL.
容解后转移壁10%mL,容量瓶中，解后转移车00品容量瓶中，定
纤后转移囊100%ml容量瓶中，定esr
后转移霆100mL.穿量瓶中，定
最7.双廿氨肽（CHCONH，COH)，湾解了70mL水中，转A. 3. 6缓冲液(pH 7.
化钠溶液（A.3.2)调节pH至7.8,加人L氯化穿溶液(A.3.5)并至10 容邑瓶中，
定容至100mL。充分混合储荐本0℃～4℃的冰箱中，此溶液可以保存四痛。A.3.7碳酸氢钠溶液(4. 0 g称取4品g碳酸氢钠(NaHC),用水辫解后转移至1 0U0 ml.容量瓶中，定容。充分混舍。
A.3.8烟酰胺腺嘌岭二核苷酸（ADH）溶液：称取50烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(CHxN,Oi.P,Na)和 100 mg碳酸氢钠(NaHr溶解于 10 mL冰r。A3.9硫酸铵溶液（422名/L）称取42.2硫酸铵[(NH）SO,，用水浴解后转移至100mL容量瓶中，定容。充分混合。
A.3.10苹果酸脱氢酶（MDH)和乳酸脱氢酶(LDII)悬浊液：用硫酸铵溶液（A.3.9)分别溶解带果酸脱氢酶（猪心，EC1.1.1.37)和乳酸脱氧酶（兔肉，EC:1.1.1.27），使苹果酸脱氧酶（MDH)的活性不低于600IU/血L、乳酸脱氢酶的活性不低于1400IU/mL。缓慢搅勾成悬油较后，储存在0℃～4℃冰箱中，此溶液可以保存一年，
A.3.11柠檬酸盐裂解酶（CL)溶液：用0℃水溶解柠檬酸盐裂解酶（产气肠杆菌，FC4.1.3.6)，使柠檬酸盐裂解醇的活不低于40IU/mL。缓慢搅匀成悬独液后，储存在0℃~-4℃冰箱Ⅱ，此溶液叫以保存一周；在一20℃冰箱中,可以保存四周。2
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GB/T 22031—2008
A3.12柠楼酸标准溶液(160μg/mL）：称取175mg一水柠檬酸（C,H.0,·H,0)用水溶解后转移至1000mL容量瓶中，定容。充分混合。A.4仪器
常用实验室仪器及以下各项。
A4.1分析天平-感量0.1mg。
A,4.2pH计:精确至±0.1.
A.4.3粉碎机。
A.4.4其塞刻度比色谱：10 mL腹值0.1mL。A.4.5
中速滤纸。
紫外可见分光光度计。
水浴锅。
试样制备
除去干酪的
干酪制靠
选择具有代
A.6分析步骤
A.6.1试液制
340r，1cm比色m
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生最的试样，用
称取1g最
量瓶中，冷却至0%
5),精确至
冉加人
纸(A,4. 5)过滤新
初滤薇药
PH至1后，再用
龙钠溶液（
笠察，同时做空白
A.6.2谢定
A.6,2. 1标准曲毁能
3)粉碎，握了
25 mL
4.3)将赋样碎，混勾。
50℃）中，全部转移100m容
定容，混合瑞句后静置30min。用滤用氢氧化纳溶覆(A.3.3)调节滤液溶液转移100mL容昼瓶中，用水
全温。准确吸取0,0.50,1.00，1.50,00 L两组柠樣酸标准溶液试剂在使用前恢
(A.3.12)，分别置于10L蒙(A.4.4)中，各加人1.00mL缓释液(3.6)、0.10mLNADH液酶(H)和乳酸脱氢酶(LJ)悬独激(A,3.10),摇匀。在 20 ℃～(A, 3. 8),0. 02 mL 苹果酸膜
25℃水浴锅(A.4.7)中保持5限-用水定容至UC-L，其中一用1cm比色血(A.4.6)，以空气作参比，在波长340nru处测定各比色管离落液的吸光度Ag%a组各加人0.02tnL的柠橡酸盐裂解酵（A.3.11)，混匀，在20℃~25℃水浴锅（A47中保得10min，用1cm比色血（A.4.6），以空气作参比，在被长340mm处测定各比色管内溶液的吸光度A1：根挪式（A.1)计算吸光度A，以柠檬酸含量为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标谁曲线。A-A, —A
式中：
柠檬酸盐裂解酶添加前的吸光度；A
柠酸盐裂解酶添加后水浴10min的吸光度。廷；如果吸光度降低超过0.800,川水液稀释样品和空白试样,重复 A 6.2. 1 步骤。A.6.2.2试液吸光度的测定
用移液管取两份2.00mL试液（A.6.1),置于10mL比色管（A.4.4)。以下步鳞同A.6.2.13
http:
nuwrfo
GB/T 22031—2008
中\各加入1.00mL缓冲液（A.3.6)-根据式（A.1)计算吸光度A\操作，在标准曲线上查出对应的柠樣酸含量：同时做空白试验。A,7 结果计算
样品中柠襟酸的含量X，以克每百克(g/100 g)表示，按式(A.2)计算：cXV. XV
X 10 000mxV,xV
式中：
标曲线上查山的试液中柠檬酸的含量，单位为微克（g）；Vr-
试样经脱蛋白处理后的定容体积，100ml.;一滤液定容体积，100mL；
-试样的质量，单位为克（g)；
吸玻滤液体积，25.00mL；
吸取试液体积，2.00mL，
计算结果应扣除空自，保留三位有效数字。A.8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不人于这两次测定值的算术平均值的10%。http:
B.1范围
附录B
（规范性附录）
干酪及加工干酪中乳糖含量的酶法到定本随录规定了酶法测定下酪及加工干酪制品中乳糖含量的力法。本附录适用于干醛及加工干酪制品中乳糖含量的酶法测定。B.2原理
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在仔半乳糖皆酶(βCLS>催化下，乳糖被海解为D-循蜀糖(G)和D-半乳糖(GL）。已糖激酶(HK)将D-葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡需糖(G6P)，同将三磷酸腺苷（ATP)转化为二磷酸腺苷（ADP)。受6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH)催化，6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸（GA6P)，同肘烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP-）被还原成还原型烟酷胺腺嘌岭二核苷酸磷酸（NADPH）。在波长340nm处NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定鼠。C.HaO.)+H,O.GLS.D-C.H.O.(G)+DC.,H.O.(GL)DC, H, O,(G)+ ATP HG6P + ADPG6PDIGA6P + NADPH + H+
G6P + NADP-+H,O
B.3试剂和材料
所有的试剂如末注明规格，均为分析纯：实验用水如末注明，均应符合GB/T6682的规定。B.3.1乳糖标准物质(CHaOu.H,0)：纯度≥99%。B.3.2亚铁氟化钾溶液（36g/L)：称取3.6亚铁氛化铆（K［Fc(CN)。·3H2U)，用水溶解，定穿至100mL，混
B.3.3硫酸锌溶液（72g/L)：称取7.2g硫酸锌（ZnSO4.7HI,0)，用水辫解，定容至100mL，混匀。.3.4磁酸溶液（21101/L）：用水稀释浓硫酸，浓硫酸：水为1：8体积比）。普告：稀释浓硫酸时应当将硫酸缓慢加入水中，且不断搅动。否则会引起爆炸。B,3.5氢氧化钠溶液（200g/L）：称取20.0g氢氧化钠（NaOH)，用水溶解，定容至100mL，混匀。B.3.6氯氧化钠落液（4g/L）：称取4.0g氢氧化钠（NaOH)用水溶解，定容至1000mT混。B.3.7蕴酸铵溶液（422g/L）：称取42.2g硫酸铵［(NH.),SO,二，用水溶解，定容至100mL，混匀。B.3.8柠檬酸盐缓冲液（pH6.6)：分别称取2.8柠檬酸钠（C,H.0,Na·2H.O)、0.042g柠檬酸(C.HaO,H.O)和0.635g七水硫酸镁（MgSO4·7HzO)溶于40mL水中，用硫酸溶液(B.8.4)或者氢氧化钠溶液（B.3.6)调节H案6.6+0.1后，用水定容至50mI混句后放置0℃~A℃冰箱中贮藏，可保存三个月，使用前放置至室温。B.3.9=乙醇胺(TEA)缓冲液(pH7.6)：分别称取14.0g盐酸三乙醇胺（C:HuNO,·HCI)和0.25g七水硫镁（MgSO,·7Hz0)，用80mL水溶解，用氢氧化钠溶液（B.3.5）调节pH至7.6主0.1.后，定容至100mL，混匀后放置0℃～4℃冰箱中贮，可保存两个月：B.3.10NADP+-ATP-TEA缓冲愁汕液：分别准确称65mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠（CaH2N,OP.Nag）和170mg5-三磷酸腺背二钠盐（CHuN,OsP.Na），溶30mL的三乙醇胺缓冲液（B,3.9)中，混匀后放置0℃～4℃冰箱中贮藏，可保持两周：使用前放置至究温。B.3.11β半乳糖苷酶-硫酸铵［PGLS-（NH,）SO,悬浊液（pH约7.6)：将β半乳糖苷酶（GLS5
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埃希氏大肠杆菌，EC3.2.1.23)溶于硫酸铵溶液(B.3.7)中.使β半乳糖苷酶的活性不低于60IU/mL，缓慢揽匀成悬浊液后放置0℃～4℃冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应没入冰水。B.3.12已糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢海-硫酸铵[HK-G6PDII-(NH..SO,门悬浊液：将色糖激（HK，酵母，EC2.7.1.1)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH，酵母，EC1.1.1.49）溶于硫酸铵溶液（13.3.7)中，使己糖激酶活性不低了2801U/mL（25℃），6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性不低于1401U/mL（25℃）。缓慢搅匀成悬浊液后放置0℃4℃冰箱1，可保存12个。使用时该悬油液的容器应浸入球水中。B.3.13乳糖标准溶液c(CH2aOu·HaO）80μg/mL精确称取经87℃烘烤2h至忆重的乳糖标准物质（B.3.1)0.812多，溶于水中，定容至100mL，摇匀。准确吸取1.00mL上述溶液，用水稀释到100mL，即得浓度为80μg/mL的乳标准工作辫液。该溶液改置0℃~1C冰箱中，现用现配。B.4仪器和设备
实验室常规仪器及以下各项。
B.4.1分析天平：蕊量0.1mg。
B.4.2定量滤纸：中速，直径15cm。B.4.3比色管：10mL，带蓝
B.4.4分光光度计：340ntu，1cm比色川。B.4.5水浴锅：能在20℃~36℃保温。B.5试样制备
取有代表性的样昂至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。B.6分析步
B.6.1试液的制备
推确称取1区样品丁烧杯中，用温水（40℃~50C）落解，玻璃棒搅拌，将烧杯中拌完全转移至100mL穿量瓶，用水定容，混匀。加人5mL亚铁氰化钾溶液（B.3.2),5ml硫锌溶液（B.3.3)和10㎡L氢氧化钠溶液（B.3.6），每次添加后充分混合溶液，用水定容至100mL，混合均匀后静置30min。过滤，弃去开始的部分滤液。吸取5.00rnL滤液于100mL容量瓶中，用水定容至100mL，即为试浚。
B.6.2标准曲线的绘制
用微量移液管吸取00.20,0.40，0.60.0.80.1.00mL乳糖标准工作溶液（B.3.13)，分别置于比色管（B.4.3)中,各加入0.20mL.柠橡酸盘缓冲溶液（B.3.8）,0.05mLβ半乳糖替酶-硫酸铵悬浊液(B.3.11),摇句,于水浴锅(B.4.5)中恒温15min，取出后加入1.00mLNADP+-ATP-TEA缓冲溶液(13.3.1.0）.0.05mL已糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶-硫酸铵恶浊液（B.3.12)，摇勺，于水浴锅（B,4.5)中恒温60min。取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，操匀，放置5min。用1cm比色血（R.4.4)，以乳糖标准率液含量为0的试剂溶液作参比，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度。以乳糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。B.6.3试液吸光度的测定
催确吸取1.00mL试液（TB.6,1)于比色管（B4.3）巾，加人0.20mL柠橡酸盐缓冲溶液（B.3.8）、1.00mLNADP+-ATP-TEA缓冲溶液(B.3.10).0,05mL已糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶-硫酸铵悬油液(B.3.12)，摇句，于水浴锅（B,4.5)中恒温60mi。取出后，冷却垒室温，用水定容至5.00mL，播匀，放置5 min，作为试被参比辫没。准确吸取1.00mL试液(B.6.1)于比色管（B.4.3)1。以下按B.6.2\各加人0.20mL柠檬酸盐缓溶液（B.3.8)放置5min\操作，用1cm比色血（B.4.1），在波长340nrm处测定各比色管内溶液6
h
的吸光度，在标准曲线上查出对应的乳糖含量，B.7结果计算
试样中乳糖的含量X，以克每百克(g/100g)表示，按式(B.1)计算：X=
式中：
cxvixV
10000mxV，xV
标推曲线上查出的试液中乳糖的含量，单位为微克（）)：试样经脱蛋白处理后的定容体积，250mL；滤液定容休积，100mL；
试样的质量，单位为克（g）：
V，---吸取游液体积，5.00mL；V4
吸取试液体积，1.00mL。
用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。B,.精密度
GB/T22031—2008
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10为，http:
atenet
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