【农业行业标准(NY)】 无公害食品 畜禽饲养兽药使用准则

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T974-2006
柑橘苗木脱毒技术规范
Criteria for the propagation of citrus virus-free budling2006-01-26发布
2006-04-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A是规范性附录、附录B和附录C是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。NY/T974—2006
本标准起草单位：中国农业科学院柑橘研究所、湖南农业大学、重庆市果树研究所、广西柑橘研究所和农业部橘及苗木质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：周常勇、蒋元晖、赵学源、唐科志、杨方云，李太盛、肖启明、李隆华、白先进。1
1范围
柑橘苗木脱毒技术规范
本标准规定了国内柑橘苗木的脱毒对象、脱毒技术、脱毒效果检测和质量要求。NY/T974—2006
本标准适用于甜橙、宽皮柑橘、柚、葡葡柚、柠檬、来檬、枸橡（佛手）、酸橙和金柑以及有关杂交种苗术的脱毒。
2引用标准
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准GB5040柑橘苗本产地检疫规程
3术语和定义
柑橘苗木citrusbudling
指嫁接苗，接穗和砧木组合的苗木。3.2
病毒病和类似病毒病害virus and virus-like diseases由病毒、类病毒、植原体、螺原体和某些难培养细菌引起的植物病害。3.3
脱毒virus exclusion
采取一定的技术措施，从受病毒病或类似病毒病害感染的植株得到无病毒后代植株的过程。3.4
茎尖嫁接shoot-tipgrafting
将嫩梢的生长点连同2个~3个叶原基，大小约0.14mm~0.18mm的茎尖嫁接于试管内生长的砧木上的过程。
指示植物indicatorplant
受某种病原物侵染后能敏感地表现具有特征性症状的植物。4脱毒对象
4.1柑橘黄龙病病原细菌（CandidatusLiberobacterasiaticus）4.2柑橘裂皮病类病毒（Citrusexocotisviroid，CEv）4.3柑橘碎叶病毒（Citrustatterleaf virus，CTLV）4.4柑橘衰退病毒（Citrustristeza yirus，CTv)引起柚矮化病和甜橙莹陷点病的株系。4.5温州蜜柑菱缩病毒（Satsumadwarfvirus，SDV）5脱毒技术
5.1应用湿热空气处理脱除柑橘黄龙病1
NY/T974—2006
按GB5040执行。
5.2应用茎尖嫁接技术脱除柑橘黄龙病和柑橘裂皮病5.2.1器材
超净工作台、高压消毒锅、恒温箱、光照培养箱、高倍体视显微镜、酒精灯、镊子（长25cm及10cm各1把）茎尖嫁接刀（自制，用宽约6mm的竹片顶端夹住双面刀片的尖头碎片，用棉线捆牢），试管（口径25mm，长150mm）及棉塞、培养血（直径10.5cm及6.5cm）和烧杯5.2.2茎尖嫁接在无菌条件下操作5.2.3茎尖嫁接前用品准备
5.2.3.1培养基
固体、液体MS培养基按附录A配方配制装人试管，每管约20ml。试管在装人液体培养基前，需在管底放人滤纸桥用约9cm直径的圆形滤纸，中央剪0.5cm见方的孔，措成圆柱形，放人管内，孔朝上）用以支撑茎尖嫁接苗。滤纸桥高度与液体培养基的液面平5.2.3.2操作垫纸
用白纸裁成64开大小，10张成叠，外用16开纸包扎。5.2.3.3茎尖嫁接刀
将自制的签尖嫁接力10把一15把扎成，捆放人试管内，刀尖朝下，悬空。管底垫少量棉花及纸以防刀尖接触管壁。管口用牛皮纸封住。5.2.3.4培养血
每个用牛皮纸包被，打捆，或放人烧杯，用牛皮纸封口。5.2.3.5培养基和其他用品的消毒将5.2.3.1、5.2.3.2、5.2.3.3、5.2.3.4各项用品放人高压消毒锅内消毒。消毒温度为121C持续20min。其中，签尖嫁接刀须用有套层的高压蒸汽消每器消每，以达到消每物品干燥的要求，避免刀口生锈，影响嫁接成活。
5.2.4砖木准备
砧木常用积橙或积的实生苗。剥去种子的内，外种皮，放人直径为10.5cm的培养血，用0.5%次氯酸销液（加0.1%吐温20）浸10min，无菌水洗3次，每次1min~2min，播于试管内MS固体培养基上，每管1粒3粒，在27C黑暗中萌发、生长，两周后可供茎尖嫁接。如暂时不用，试管罩上塑料袋，直立放入4℃~8C冰箱内备用。
5.2.5茎尖准备
采1cm~2cm长的健壮嫩梢，摘除下部较大叶片，放入直径为6.5cm的培养血，经0.25%次氟酸钠液（加0.1%旺温20）浸5min，无菌水洗3次，每次1min~2min备用。5.2.6茎尖嫁接
高倍体视显微镜放超净台上，用棉球蘸消毒酒精擦手及台面，点燃酒精灯，将大、小镊子在灯上灼烧消靠：将操作垫纸放在双高扩大锐镜台上，用裁子取出贴木苗（以选用直径0，1cm以上的为好）放于纸上，截顶留1.5cm茎，切去根尖留4cm~6cm根，去子叶和腋芽。在放大10倍的镜头下操作，在砖木顶侧开倒T形切口，横切一刀，竖切平行两刀，深达形成层，两刀间距以能放人茎尖为宜，挑去三刀间的皮层，形成U字形切口。取5.2.5准备好的梢段，切下生长点连带2个～3个叶原基，长度为0.14mm~0.18mm的茎尖，放人切口，圣尖切面与站木的横切面相贴。将圣尖嫁接苗放人盛有MS液体培养基的试管内。
5.2.7茎尖嫁接苗管理
将装有孝尖嫁接苗的试管置于26C27C恒温下培养，每天光照1000Lux16h，黑暗8h。5.2.8茎尖嫁接苗的再嫁接
NY/T9742006
待试管内茎尖嫁接苗长出2个～3个叶片稍老化时，将茎尖嫁接苗从试管内取出，切去根部，留长1cm～1.5cm贴木的茎，削去一侧皮层，嫁接在网室内盆栽砧木倒砧口下侧顶部。上套聚乙烯薄膜袋保湿，成活后去待再发新梢老化后截贴53应用热处理十茎尖嫁接脱除柑桶碎叶病、温州蜜柑缩病和柑插衰退病供脱毒的植株每天在40C有光照条件下生长16h和在30℃黑暗条件下生长8h，连续10d60d后，采嫩梢1cm～2cm进行茎尖嫁接。茎尖嫁接程序茎尖嫁接苗管理及再嫁接与5.2相同。6脱毒效果检测
6.1指示植物检测
见附录B。
6.2生物化学和分子生物学方法检测见附录Cs
7质量要求
经湿热空气处理、茎尖嫁接或热处理+茎尖嫁接脱毒处理所得苗木，每株需经检测，用指示植物检测不显症状者或用生物化学和分子生物学方法检测呈阴性者为合格；用指示植物检测有症状者或用生物化学和分子生物学方法检测呈阳性者为不合格。n
NY/T974—2006
CaCh-2Ho
MgSO.-7HO
MnSO,-4HO
NnMoO.-2HO
CuSO.-5HO
CoCh-6HO
NagEDTA
FesO-7HO
蒸馏水
MS固体培养基
附录A
（规范性附录）
尖嫁接用培养基配方
CaCh2HO
MgSQ.·7HO
MnSO,-4H.O
Na-MoO.-2HO
1000ml
CuSO.-5HO
CoCh·6Ho
NaEDTA
FeSO.·7HO
盐酸硫胺素
盐酸吡哆醇
蒸馏水
MS液体培养基
1000ml
裂皮病
碎叶病
黄龙病
釉矮化病
甜橙鉴陷点病
温州蜜柑菱缩病
生物化道
血清学
附录B
（资料性附录）
应用指示植物检测柑橘病毒病和类似病毒病害表B.1
指示植物种类
（品种）
Etrog香橡的亚利桑那
861或861-S1选系
Rusk根橙
桃柑或甜概
凤凰柚
madam vinous甜楼
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鉴别症状
嫩叶严重向后卷
叶部黄斑、叶缘缺损
叶片班驳型黄化
茎木质部严重陷点
基木质部严重陷点
叶部枯斑
附录C
（资料性附录）
适于发病的温度
应用生物化学和分子生物学方法检测柑橘病毒病和类似病毒病害表c.1
A蛋白酶联免疫吸附法（DAS-ELISA)双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）双向桑丙烯酰胺鼠胶电泳（sPAGE）多聚酶链式反应(PCR)
分子生物学
反转录多集酶链式反应（RT-PCR）半巢式反转录多聚酶链式反应（Semi-nestedRT-PCR）NY/T974—-2006
鉴定一植株所霜
指示植物株数
检测对象
温州蜜柑萎缩病毒
柑橘醇叶病藓
柑橘裂皮病类病毒
柑橘黄龙病病原细菌
柑橘裂皮病类病毒
柑桶碎叶病毒
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