【国家标准(GB)】 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准Www.bzxZ.net
GB/T 21674—2008
猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法Detecting porcine circovirus with polymerase chain reaction2008-04-09发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-06-01实施
本标准附录 A为规范性附录，
本标准由中华人民共和国农业部提出。言
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标雅起草单位：农业部兽医诊断心。本标准主要起草人：田充恭、王宏伟、孙明、王传彬、陈西。GB/T 21674—2008
GB/T21674--2008
猪国环病毒依据其致病性和基因组差分为无致病性的猪圆环病毒I型（porcinecirrovirustypcl，PCV-1)和有致病性的猪圆环病毒Ⅱ型(parcine circovirus type2,PcV-2)。PCv-2是引发猪断奶后多系统衰弱综合征（post-weaningmultisystemwastingsyndromc，PMwS）的主要病原。该病主要以息畜生长迟缓、进行性消瘦和多系统病理损你为特征，给世界各国主要养猪地区的规模化养猪业造成了一定的经济损失。
1范围
猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法本标推规定了猪厕环病(PCV)聚合酶链反应(PCR）检测方法的技术要求。GB/T 21674—2008
本标准适用猪血消和组织中的猪圆环病毒检测，以及其I型(PCV-1)和Ⅱ型(PCV-2)的鉴别。实验室生物安全要求
试验操作应在生物安全Ⅱ级(BSI-2级)以上的实验室进行。3实验材料、仪器设备和试剂
3.1实验材料
眼科剪、眼科镊，称量纸、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量简500mL锥形瓶、吸头（10μL，200L、1000μL）、灭菌双蒸水。3.2仪器设备
分析关乎、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮链或一70℃冰箱.微波炉、组织研磨器一20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最火量程为2μL、20μL.200μL.1000uL)
3.3试剂
本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。3.3.消化液（见第 A,1章）
3.3.22%蛋白K溶液（见第A.2章）。3. 3. 3酚-三氟甲烷-异戊醇滩合液(见第A:3章）。3.3.42.5mmol/LdNTP(见第A.1章)。3.3.510 pmol/I.PcV物（见第A.5章)3.3.60.5U/uLTaqDNA合酶（见第A.6章）。3.3.710倍PCR缓冲液（见第A.7章），3.3.8
化乙锭（EB)液（苑第A.8章）。电泳缓冲液（50倍）（见第A.9章）。3.3.10
1%琼脂糖凝胶(见第 A,10章
上样缓冲液（见第A11章）。
异丙醇。
75%乙醇（见第A.12章）。
15 mmoL/L 氯化(见第 A,13 章)灭菌双蒸水（见第A,14章）。
电泳缓冲液（1倍）（见第A.15章）。4操作程序
4.1样品的来集与处理
4.1.1样品的采集：死猪、扑杀的成年猪和流产胎儿取肺脏和淋巴结；幼龄猪取心脏；得检活猪，用注射器取血 2 mL~4 mL,立即送往实验室。1
GB/T 21674—2008
4、1.2样品的处理，每份样品分别处理4.1.2.1组织样品处理：取待检病料约0.2g置研磨器中剪碎并研磨，加人2mL消化液(3.3.1)继续研磨，取巨研磨好的待检病料上清100μL，置1.5ml灭南离心管中，再加人500uL消化液（3.3.1)和10±L2%蛋酶溶液（3.3.2)混勾，置55C水裕中4h-16h4.1.2.2清样品处理：待血液凝固后，取上清放于离心管中，1℃8000g离心5min，取上清100μL，置1.5m工火菌离心管中，加人500uL消化液（3.3.1)和10μ1.2%蛋白酶K浴液（3.3.2)，港匀：置55℃C水浴中4h~16h
4.1.2.3阳性对腹处理：分别取PCV-1.和,PG2细跑培辨落备100μL，骨1,5 ml.火菌离心管中，每管加人500L消化液（3.3.1)和102%蛋白酶K溶液（3.3.2岁强勺，置55C水浴巾4h~16h。4.1.2.4阴性对服处理：取灭菌收蒸水100置5mh炎菌离心管，加人500L消化波（3.3.1）10μL2%蛋白酶K溶液（3.3）氢55℃水浴中4h～164.2DNA模板的提取
4.2.1收出已处理的待检品最阴性、阳性对照样品，每管加入600酚三(3.3.3),用力颠倒10送穿13000
4.2.2取清500#
70C冰箱中30m
4.2.3弃上清，沿高心
e 1/5 ml.
出离心竺
开口方间
转洗次后倒掉，广臀倒扣于项
4.2.4 取出离心
50L灭菊
4.3PCR扩增
每管取灭菌爆8，2.51
氯化镁（3.3.14）、PCR缓冲落
2，混勾，作好标记，人矿物油丝条件步 91 ℃ 30 s、黑
5 s.72℃
4.4电泳
将PCR扩增产L与3
琼脂糖胶板一侧点馨人100
紫外凝胶成像仪卜观察
5结果判定
min,真空描于
NTP(3. 3. 4).
香环后，了2℃
氯中烷-号成醇混合液
$.3.12鑫混引置液氮中3min或
75%乙（3.3毫13)溶液，轻轻施
PCV物3.35）,15mmo1/L
合酶(3.3.助各uI,DNA模板
热循环仪香用地矿物汕）。扩增1头琼脂糖胶(3. 3. 1.0)孔中，物），以惠v/品电压电泳40min，：
当PCV-1阳性对照出现52p扩带，PCV-2阳性对照出现1154p扩增带，阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。被检样品出现652命护增带为PCV-1阳燃，山现1154bp扩增带为PCV-2阳性，未出现相应扩增带的样品判为附性2
A.1消化液
(规范性附录）
试剂的配制
A.1.11mol/L三羟甲基氢基甲烷-盐醇6P-HCTP&0三羟基甲基氨基甲烷
灭菌双蒸水
浓盐酸
灭菌双蒸水
A. 1. 2 0. 5 mal/L 2
二水乙二铵μ乙
灭菌双蒸水
氢氧化钠
灭菌双蒸水
A.1.3 20%+
十二烷磷
灭菌双蒸水
浓盐酸
灭菌双蒸廖
A,1.4消化液
老酸二钠E
硫酸钠（SI
1 o1/I.三甲拿氨基甲烷
0, 5 mol/1.
20%十二烷
5 mol/L氯化
灭菌双蒸水
四乙酸二
钠溶液（
A.22%蛋白酶K溶滴
蛋白酶K(分析纯）
灭菌双蒸水
A,3酚-三氯甲烷-异戊醇混合液
碱性酚
三勉甲烷
异茂醇
A.4 2.5 mmol/1, dNTP
dATP(100 mmol/L)
dTrrP(100 mmol/L)
dGTP(100 mmol/L)
dCTP(100 mmol/L)
灭菌双蒸水
溶液（
HCL)(pH8.
调 pI率 8. 0
加至100L
pH至0
至100l
PH 至 7. 2
至100ml
20 μL
20 μl
加800
GB/T 21674—2008
GB/T21674--2008
A.510pmol/ulPCV引物
引物序刻
P1 : 5*-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3*P::5′-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3*P. :5*-ACCCCCGCCACCGCTACC-3*上游物（20D）加人375.4灭菌双水溶解，下游引物P（2Q1>2）加人326.6μT.灭菌双蒸水溶解，下游引物P，（2ODaso）加101.9灭菌双蒸水溶解，分别取P，、P.P：溶液各300L，混即为10pnol/uLPc物。
A. 60. 5 U/uL Tug BNA 聚合酶5 U Tag DNA 聚合酶
灭菌双蒸水
现开现配。
A.710倍PCR缓冲液
A.7.11mol/I,兰羟甲基氮基甲烷-盐酸(Tris-IICL)(pH9.0)羟基甲基氢基中烷（分析纯）
灭菌双蒸水
浓盐酸（分析纯）
灭菌双蒸水
A.7.210倍PCR缓冲液
1mol/L三羟中基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)(pH9.0)氯化钾（分析纯）
曲拉通X-100（分析纯）
灭荫双蒸水
A.8澳化乙锭(EB)溶液
溴化乙
双菌双蒸水
A.9电泳缓冲液（50倍）
A9.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA)溶波（pH8.0)二水乙二铵四乙二钠（分析纯）灭菌双蒸水
氢氧化钠
灭菌双蒸水
A.9.2TAE(三羟甲基氨基甲烷-乙酸)电承缓冲液(50倍）羟基甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯)冰乙酸
0.5tn1/L乙二铵四乙二钠榕液(pH8.0)灭菌双蒸水
用时用灭菌双蒸水稀释使用。
1 jμL
加率10 μL
调 pH 至 9. 0
加至100 mL
加至 100 mL
加垒20 mL
调 pH至 8. 0
加至100 mL
242客
加垒 1 000 mL
A.101%琼脂糖凝胶
琼脂糖（电泳级）
TAE电泳缓冲液(50倍）
灭菌双蒸水
196 mL
微被炉中完全融化，加溴化艺链(EB)液20 μLA.11上样缓冲液
GB/T 21674—2008
溴酚蓝0.2良，加双蒸水10mL过夜溶解。50g煎糖加入50ml水溶解斤，移人已溶解的溴酚蓝溶液中,擦勾定容至 100 mL,
275%乙醇
无水乙（100%）（分析纯）
灭菌双蒸水
315mmol/L氟化镁
氯化镁（分析纯）
灭菌双蒸水
A.14灭菌双蒸水
750 mL
100 mL
1000ml.双蒸水（电阻≥18.2Q），放于高压锅中，121℃高压20min后取出备用，A,15电泳缓冲液(1 倍)
电泳缓冲液(50倍）
灭菌双水
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