【地方标准】 J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程

ICS07.080 B41 备案号：44781-2015 分类号案卷号件号 G4AI 122 DB44 广东省地方标准 DB44/T1411--2014 J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程 The LAMP detection of subgroup J avian leukosis virus 地方标准信息服务平台 2014-08-18发布 广东省质量技术监督局 2014-11-18实施 前言 本标准按GB/T1.1-2009的规则进行编写。本标准的附录A为资料性附录。本标准由广东省农业厅提出并归口。本标准起草单位为华南农业大学兽医学院，主要起草人包括曹伟胜、罗开健、樊惠英、徐成刚等。本标准首次发布。 1 范围 本标准规定了J亚群禽白血病病毒（ALV-J）的环介导等温扩增试验（LAMP）检测规程，适用于J亚群禽白血病病毒的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是不可或缺的。注日期的文件，仅所注日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本标准。GB/T26436-2010确定的术语和定义适用于本标准。 3 术语和定义 3.1 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP） 是指一种新型核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）作用下，于60℃~65℃恒温条件下，经过15~60分钟实现靶核酸的高倍扩增。3.2 特异性引物 是指针对特定DNA片段设计的一小段人工合成核苷酸，与靶DNA片段互补。 4 J亚群禽白血病病毒的LAMP检测 4.1 仪器、材料及试剂 4.1.1 仪器设备 PCR仪、凝胶电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、高速台式离心机（离心速度≥12000 r/min）、台式或手掌式离心机（离心速度≥3000 r/min）、移液器（水量范围0.1~1000 μL）、水浴箱、旋涡振荡器。4.1.2 材料 0.5 mL和1.5 mL离心管。4.1.3 pH7.4 0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS） 称取磷酸氢二钠1.096 g、磷酸二氢钠0.316 g和氯化钠8.5 g，溶解于950 mL蒸馏水中，调pH至7.4，定容至1000 mL，灭菌后使用。4.1.4 组织裂解液 10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）：1 mmol/L EDTA：0.5% SDS。4.1.5 蛋白酶K（10 mg/mL） 将1 g蛋白酶K溶于50 mL灭菌水中，摇动至完全溶解，灭菌水定容至100 mL。4.1.6 RNase A（10 mg/mL） 取0.5 g RNase A溶于40 mL灭菌水中，溶解后定容至50 mL，100℃煮沸15 min，冷却至室温，分装后置于-20℃保存。4.1.7 75%乙醇溶液 取无水乙醇750 mL，加灭菌水定容至1000 mL，-20℃保存。4.1.8 溴化乙锭（10 mg/mL） 取1 g溴化乙锭加入90 mL水，溶解后定容至100 mL，避光保存。4.1.9 50× Tris-冰乙酸电泳缓冲液（TAE） 在500 mL水中依次加入Tris 242 g、冰乙酸（无水）57.1 mL、pH8.0 0.5 mol/L EDTA 100 mL，加水定容至1000 mL。4.1.10 1× TAE缓冲液工作液 50× TAE缓冲液20 mL，加水定容至1000 mL。4.1.11 1%琼脂糖凝胶 将洁净制胶板水平放置，放上梳子。称取1.0 g琼脂糖于三角瓶中，加入100 mL 1× TAE缓冲液，加热溶解，冷却至约50℃后加入5 μL 10 mg/mL溴化乙锭，混合均匀。沿胶板边沿缓慢注入，凝胶厚度控制在4~5 mm，凝固后放入电泳槽中加1× TAE电泳缓冲液至覆盖凝胶。拔出梳子以备加样电泳。4.1.12 电泳凝胶加样缓冲液 蔗糖40 g、pH8.0 0.5 mol/L EDTA 20 mL、10%十二烷基磺酸钠（SDS）5 mL、溴酚蓝50 mg。